免疫沉澱與免疫共沉澱原理及方法
一、基本概念
免疫沉澱（immunoprecipitation）是利用抗體可與抗原特異性結合的特性，將抗原（常為靶蛋白）從混合體系沉澱下來，初步分離靶蛋白的一種方法。
免疫共沉澱（coimmunoprecipitation）是一種在體外探測兩個蛋白分子間是否存在特異性相互作用的一種方法。其原理是如果兩個蛋白在體外體系能夠發生特異性相互作用的話，那麼當用一種蛋白的抗體進行免疫沉澱時，另一個蛋白也會被同時沉澱下來。與酵母雙雜交技術不同，免疫共沉澱技術所利用的是抗原和抗體間的免疫反應，是一種基於體外非細胞的環境中研究蛋白質與蛋白質的相互作用的方法。
不難看出，免疫共沉澱與免疫沉澱技術所使用的原理與方法大致相似，所不同的是，在免疫共沉澱中，對靶蛋白的結合與沉澱由另一個與之發生相互作用的蛋白替代。在免疫共沉澱或免疫沉澱的基礎上，通過進一步與其它技術的結合，如聚丙烯醯胺凝膠電泳，還可進一步對靶蛋白的的分子量等特性進行鑒定。
二、抗體的選擇（一）多克隆抗體
多克隆抗體因其製備相對簡單，可與靶蛋白分子的多個位點結合，所形成的抗原抗體複合物較穩定因而應用的最為廣泛。但多克隆抗體的缺點在於非特異性結合較多，常會導致反映本底（是否是背景）升高和一定的假陽性結果。
（二）單克隆抗體
與多克隆抗體相比，單克隆抗體往往只結合一種抗原表位，具有單一結合特異性，所以發生非特異結合的機會少，可被用於確定靶蛋白上某一部位的特殊結構，甚至可被用於區分相同靶蛋白的不同形式如構象變化和修飾。但反過來，單克隆抗體僅與單一表位結合的特性也會引起具有同一表位的不同靶蛋白間的交叉反應。
三、免疫沉澱方法免疫沉澱的靶蛋白一般來自細胞裂解液，可以是被同位素標記的也可以是未被標記的。若為前者，免疫沉澱後再經聚丙烯醯胺凝膠電泳，只需壓片即可檢測到靶蛋白的存在；若為後者，經免疫沉澱和聚丙烯醯凝膠電泳後，尚需藉助銀染或免疫印跡進行鑒定。
（一）所需試劑及溶液改良的RIPA液（細胞裂解液）、稀釋緩衝液（常用PBS溶液）、TSA溶液、0.05mol/lTris（pH6.8）、2×SDS蛋白上樣緩衝液、抗體與Sepharose或抗免疫球蛋白抗體、蛋白A、蛋白G的交聯物。
改良的RIPA液的組成（100ml體系）：Tris-HCl: 50 mM（pH 7.4）、NP-40: 1%脫氧膽酸鈉（0.25%）、NaCl（150 mM）、EDTA（1 mM）、PMSF（1 mM）、抑肽酶、亮肽酶素、抑肽素（各1μg /ml）、Na3VO4（1 mM）、NaF（1 mM）。 （二）方法1．用冰冷的PBS溶液洗滌貼壁細胞兩次，棄乾淨PBS。（對於懸浮細胞則用台式離心機以800-1000rpm轉速通過離心洗滌）。
2．給細胞培養瓶中加入冰冷的改良RIPA液，RIPA液的用量：按照1 ml/107 細胞/100mm 培養面/150cm2瓶或 0.5 ml每5×106 細胞/60mm 培養面/75cm2 瓶計算。
3．用經蒸餾水預冷的橡皮或塑料細胞刮棒將貼壁細胞轉移至一離心管中，輕輕混勻細胞懸液，用振蕩器在4℃振蕩15min以裂解細胞。
4．於4℃，14000g離心裂解液15min，迅速轉移上清至另一離心管中，棄掉沉澱。
5．準備蛋白A（蛋白G或Sepharose）：用PBS洗滌蛋白A（蛋白G或Sepharose）珠子兩次，並將其用PBS調製成50％懸液。
6．每1ml細胞裂解液上清加入100μl蛋白A，4℃，振蕩10min，進行預清除。
7．4℃，14000g離心10min移去蛋白A（蛋白G或Sepharose）珠子，轉移上清至一新離心管中。
8．用Bradford法（考馬斯亮藍染色法）測定蛋白濃度。（應至少將細胞裂解液作1：10稀釋後再測定，這是因為存在於裂解液中的去污劑成分會干擾考馬斯亮藍的作用）。
9．根據所測得的細胞裂解液蛋白濃度，用PBS將其稀釋至1mg/ml以降低緩衝體系中去污劑的濃度（但對於那些在細胞中表達水平較低的蛋白而言，10mg/ml這樣更高的濃度可能對免疫沉澱更有效一些）。
10．加入推薦體積的免疫沉澱抗體至500μl細胞裂解液中。（抗體的最適用量要根據每一細胞模型中免疫沉澱靶蛋白的數量來確定）。
11．將細胞裂解液與抗體輕輕混勻後孵育2h，或置搖床上振蕩
12．通過脈衝離心（14000 rpm，5s）收集瓊脂糖/Sepharose珠子，棄掉上清，用800μl冰冷的改良RIPA緩衝液洗滌珠子3次。
13．將瓊脂糖/Sepharose珠子重懸於60μl 2×SDS蛋白上樣緩衝液中，輕混均勻後煮沸5min，200g離心1min棄掉珠子。
14．將上清轉移至一新離心管中推薦閱讀：