中藥藥理研究方法簡介

中西醫結合專業研究生班講座題目：中藥藥理研究方法簡介中藥現代化研究是離不開藥理學的研究方法，而藥理學的研究方法又主要藉助於生理學、生化學、免疫學、分子生物學和形態學的方法和手段逐漸發展起來。在中藥藥理研究過程中，方法的選擇是至關重要的，而中醫中藥的研究又有其獨特的方面，即中醫的病症與現代醫學研究採用的模型是否吻合，用現代醫學研究的方法和手段能否反映出中醫中藥研究的特色，這是多年來中西醫研究過程中一直在探討和需要解決的問題。下面僅從幾個方面粗淺地介紹藥理學研究過程中的一些常用的方法和手段，旨在為中醫中藥的研究提供參考。一、概 述（一）基本研究方法1. 離體實驗（體外實驗）（1）離體器官：心臟、子宮、腸管、氣管、血管條、神經等；（2）離體組織：腦組織（海馬腦片培養）、肝組織培養；（3） 體外培養細胞：血細胞、心肌細胞、腦細胞、膠原細胞、腫瘤細胞、試管內或培養基內的細菌和病毒等；（4）體外實驗的優點：實驗重複性好，用藥量少（適合於提取合成的藥物），節省動物，效果直觀，主要用於藥物作用機制的分析；（5）體外實驗的不足：實驗條件要求嚴格，結果易受藥物中的雜質和理化性質的影響，有時與整體實驗的結果不符合。2.整體實驗：包括正常動物和病理模型。（1）正常動物實驗：觀察在正常機體機能狀態下，藥物產生的影響。如藥物對正常動物血壓的影響，對動物行為活動的影響。又分為急性實驗（短期內如一次給葯或連續3~7天給葯）和慢性實驗，如藥物長期毒性測定，藥物延長壽命實驗等。藥物對正常動物產生的作用只能說明藥物作用的趨勢，並不能完全說明藥物就對該系統的疾病狀態產生治療作用。（2）動物的病理模型l模型的製造：腎虛模型 高血脂模型 高血壓模型 心肌缺血模型痴呆模型抑鬱模型l模型的特異性：製造的模型是否與臨床疾病的病理、病理生理過程吻合，有效的治療藥物能否改善模型的某些癥狀，藥物在模型上的治療作用能否在病人身上同樣有治療作用。如用於抑鬱和抗抑鬱葯研究的抑鬱動物模型。l模型的選擇：根據研究的目的和要解決的問題有針對性的選擇模型。如補腎壯陽葯要選擇腎虛模型，要觀察藥物對動物耐力的影響；益智葯研究要選擇呆傻的動物模型（認知、記憶和鞏固的不同階段觀察藥物的作用）等。（二）研究題目的選擇：中醫學理論淵博久遠，中藥資源是我國的寶庫，具有廣大的研究潛力，作為研究生如何在有限的時間內選准題目，進行有意義的研究。下面僅就中藥研究方面提出幾點想法。1.尋找秘方、驗方，進一步發掘；2.在驗方的基礎上，重新組方；3.開拓秘方、驗方新的適應症；4.單味葯有效部位、有效成分的研究；5.中藥復方和單方製劑的研究。（三）實驗設計1. 建立實驗假象2.根據實驗目的，確定實驗動物、觀測指標、動物模型動物的選擇：注意動物對藥物反應的特異性（1）觀測指標：客觀性和可測量性（定量或定性）（2）動物模型：除觀測藥物對正常動物的影響外，還要在疾病的動物模型上進行研究，如降壓藥（正常動物，腎性高血壓模型，自發性高血壓模型）3.劑型、劑量、給葯途徑和給葯時間（1）劑型：選擇劑型的原則是在保證藥物活性不變的情況下，選擇便於保存、攜帶、用藥和充分發揮藥效的劑型，同時注意中藥的特點。（2）劑量：實驗研究所用劑量的確定主要根據藥物的LD50。如果實驗藥物分為3個劑量組，則高劑量組是1/10 LD50, 中劑量組是1/30LD50，低劑量組是1/90LD50；如果研究用藥的LD50測不出來的話，根據臨床用藥量按體表面積進行換算。（3）給葯時間：根據臨床用藥的經驗和研究的目的決定實驗用藥每天給葯的次數和天數。（4）給葯途徑：與臨床給葯途徑相一致。4. 實驗分組： 空白對照組模型對照組陽性藥物對照組實驗用藥組每組動物所用的例數根據實驗設計的要求而定。5. 實驗設計的基本原則：（1）重複（2）隨機（3）對照：組間對照自身對照配對對照（四）實驗結果的處理和分析1. 結果正確性的判斷：實驗條件控制的嚴密性，實驗數據的客觀性，技術上有無問題，實驗設計上有無漏洞（慎密的實驗設計是非常重要的）等。2.結果的統計學處理：根據實驗資料選擇不同的處理方法。注意的問題是：（1）不要隨意拋棄數據，如偏差過大的數據（超過3個SD）可廢棄不用。（2）注意有效數字和誤差之間的關係：測量所得數字的位數，用來表示測量的精密度如：a. 2.5~3.53.02.95~3.03.002.99~3.000.001 是1位有效數0.0025 是2位有效數b. 應用百分數時要注意：（a）分母不能太小，如1/3不等於33.3%；1/5不等於20%。（b） 測得20隻動物死亡率是50%，10隻動物死亡率是10%，100隻死亡率是5%，不等於50%+10%+5%/3 =21.7%，而是50%x20+10%x10+5%x100/20+10+100=12.6%。（c）A組死亡率是90%， B組死亡率是30%；錯誤的比較是 A/B=3倍，B/A=1/3倍；正確是A-B=60%。3.數據的表達：（1）表格（2）線條圖（3）照片（五）影響實驗的因素1. 動物因素：（1）種屬差異：包括量和質的差異，如巴比妥類藥物對不同種屬動物催眠時間的差異；組胺可使貓、狗血壓下降，而使兔血壓升高，豚鼠支氣管收縮，迴腸平滑肌興奮增高。酒石酸銻鉀可使狗、貓、鴿子嘔吐，但兔和大鼠不吐。兔對阿托品類降壓不敏感（體內代謝快）。（2）性別差異：不同性別大鼠對有機磷毒性反應不同，對環己巴比妥的催眠時間有差異。所以，實驗時要雌雄均用。2.環境因素：不同溫度氯丙嗪的 LD50不同（低溫或高溫時，LD50小，毒性大）；苯丙胺在高溫時死亡率高；一隻籠子放1隻鼠死亡慢，放5隻鼠死亡快。不同季節蛙對洋地黃的最小致死量不同；食物中含二甲基硫胺、苯吡喃酮不同，小鼠腫瘤發生率不同。3.藥物因素：藥物的溶解度、吸收情況、給葯途徑、試劑是否標準等。實驗中的誤差主要來自系統誤差如天平稱量不準，不同天平精密度不同，量筒和滴定管的差異等。稱量藥物量越少，誤差越大；溶液稀釋時，一次稀釋誤差小，稀釋多次誤差大。二、藥理實驗常用的方法介紹（一）心血管藥物的實驗方法1. 強心作用藥物的實驗方法（1）了解心衰時病理生理變化：◇ 心肌收縮力減弱◇ 心臟負荷增加◇ 神經體液調節失常◇ 心肌肥厚（2）在體心臟方法：△ 心肌收縮力的測定：動物選用犬、貓或兔，麻醉、固定、開胸手術，暴露心臟，於右肺動脈根部及左心尖處各逢一線，連於心臟描記器，記錄心肌收縮曲線。6%戊巴比妥鈉（約20-60mg/kg）靜脈注入，造成心衰。然後，給予所試藥物，測定有無強心作用。△ 心臟血流動力學測定：動物方法同上。心臟暴露後，於心尖部插入一導管，測定心室內壓；分離主動脈根部和左冠狀動脈，測定主動脈流量和冠脈流量；及分離股動靜脈，測定血壓、給葯和動靜脈氧含量。觀測指標：LVDP, LVEDP, ±dp/dp（max）, 心臟指數，心博指數，血壓，平均動脈壓，心肌耗氧指數等。△ 心肌組織學檢查：取衰竭心臟和治療後心臟做組織學檢查，觀察藥物對心肌結構的影響。（3）離體心臟實驗：△ 離體蛙心實驗△ 離體心肌實驗：取貓、豚鼠、兔、狗的乳頭肌放入充滿K-H液的浴槽中，通氧，描記收縮曲線，比較給葯前、後的收縮幅度。△ 體外培養心肌細胞實驗：取乳鼠心室肌，剪碎，胰蛋白酶消化成單細胞，培養48小時，鏡下觀察和比較給葯前後不同時間細胞搏動的情況。△ 心肌細胞酶實驗：測定ATP酶的活性。2. 抗高血壓藥物實驗方法降壓藥與抗高血壓葯的區別：有降壓作用的藥物並不一定能用於治療高血壓，如氨茶鹼；酚妥拉明能夠擴張血管，但不一定降壓。（1）根據高血壓發生的機制，藥物選擇的作用靶點：△減少血容量△降低交感神經的張力△擴張血管△抑制血管緊張素轉換酶（2）藥物對正常動物（清醒或麻醉）和離體血管條的作用：從實驗結果中推測藥物是否具有降低血壓的趨勢。（3）藥物對實驗性高血壓模型的降壓作用：△ 神經原性高血壓模型（Neurogenic hypertension）a.刺激高級神經中樞：緊張性勞累性精神刺激（電、化學、物理刺激）；b.切除頸動脈竇、主動脈弓減壓神經；c.損傷延腦孤束核：手術機械損傷或給予強烈的電刺激或化學損傷（6-羥多巴胺）d.注射膠體於硬腦膜腔內，使腦壓升高；e.向腦室內注入藥物，如血管緊張素△ 腎性高血壓模型（Renal hypertension）利用結紮法、夾住法或一側切除法形成慢性單腎或慢性雙腎腎性高血壓，然後評價藥物的作用。該模型主要反映高腎素型高血壓。△ 鹽皮質激素性高血壓模型（Hormonal hypertension, DOCA）鹽皮質激素具有保鈉、保水，增加血容量，升高血壓；同時，又使得中樞α2受體活性降低，而發生高血壓。在評價藥物時可與慢性腎性高血壓模型配合。△ 高鹽性高血壓（Hypertension with high salt intake）形成機制：血容量增加；血管反應性改變，對內源性血管活性物質反應性增高，而發生高血壓。△ 自發性高血壓大鼠模型（Spontaneous hypertension rat, SHR ）將高血壓大鼠近親交配可獲得SHR。SHR大鼠成功率雄性90%，雌性58%。SHR亞型：肥胖型高血壓：SHR+高血脂動脈粥樣硬化型高血壓：SHR+高膽固醇卒中型高血壓：SHR+腦癥狀（4）抗高血壓葯降壓機制分析△ 離體實驗△ 血管平滑肌細胞培養，測定對各種離子的影響△ 對交感神經放電的影響△ 對內源性血管活性物質的影響3. 抗心律失常葯動物實驗（1）動物選擇：△ 種類：除離體蛙心外，不選擇冷血動物；大動物與小動物的區別，小動物（鼠、兔、豚鼠、貓）形成室顫時心臟可以自行恢復（環行傳導通路短，當衝動落在不應期時可以消失），而大動物（狗、猴、豬）則不易自行恢復。小鼠和大鼠對誘導心律失常藥物哇巴因不敏感，而豚鼠對其敏感（幾千倍），貓、狗、豬敏感，與人相似。△ 標本：離體心臟，離體心房、心室乳頭肌、心肌細胞等。△ 給藥方法及評價：大鼠心跳300-400次/分，小鼠心跳400-600次/分，兔心跳200-300次/分，貓、狗心跳100多次/分，以心電圖二導聯記錄心電變化評價藥物的作用。治療給葯（自身對照）：在心律失常時給葯；預防給葯（組間對照，口服給葯多在1小時前，靜注時1-5分鐘可立即給葯）：比較心律失常持續時間、程度。（2）實驗方法：◇電刺激法：a.整體實驗：麻醉動物（貓、兔），給予適當的電刺激，引起可逆性心律失常（對心臟幾無損傷）。方法：電極放置在主動脈處，形成心房心律失常；電極放在心室上，引起室性心律失常。根據刺激強度控制心律失常的程度，一般以房顫、室顫為指標，找出給葯前閾值，給葯後再找出閾值，進行閾值比較。閾值多為2-3次的均和，每隔3分鐘刺激一次，給葯後10~15分再重複刺激。b.離體標本：將電極放置心臟表面，找出給葯前後最大耐受，比較給葯前後的變化。（也可測定REP）◇冠狀動脈結紮法：a.動物：狗、貓、兔、大鼠b.部位：冠脈左前降枝，結紮部位不同，死亡率不同c.結紮方法：二期結紮法，首先不紮實，促進側枝循環代償，30分鐘後再紮實，可降低死亡率。結紮後5-7小時可出現室性早博到室速；10-36小時可以進行實驗。d.原理：結紮後→心肌缺血→興奮性增高→異位節律→心肌損傷→釋放出K+→對心肌產生抑制↓上述作用使得心肌不協調，加重心律失常e.缺點：對利多卡因效果差。◇化學物質引起的心律失常：a.氯仿（CHCl3）：主要作為藥物的篩選。動物為小鼠，吸入氯仿3-5分鐘，呼吸停止，取出心臟，可見心室纖顫。利多卡因、苯妥因鈉效果差，而其它藥物多有效。發生的機制認為與植物神經系統、腎上腺髓質有關。b.腎上腺素：兔，靜脈快注腎上腺素（10-100μg/kg），但形成心律失常持續時間短，約2-5分鐘，多出現室早、室速和室顫。此法的優點是可反覆給葯，每隔1小時重複，自身對照，並可觀察抗心律失常葯作用持續的時間，心得安效果最好。c.烏頭鹼（Aconitine）：與熱不穩定，容易被破壞。局部用藥（濃縮後滴在心臟上或以結晶放在心臟上）引起房性心律失常；全身靜脈給葯（20-30μg/kg,股靜脈或舌靜脈給葯）引起室性心律失常（Vp→Vt→Vf）。大鼠、豚鼠、兔出現心律失常可維持40-60分鐘，室速可維持60分鐘以上或2-3小時以上。主要影響0相動作電位促進Na+內流，又叫Na+通道開放劑。d.氯化鋇（Bacl2）：動物選擇大鼠或兔。大鼠多以烏拉坦麻醉，給予氯化鋇5mg/kg；兔多以水合氯醛麻醉（300mg/kg,ip），給予氯化鋇4mg/kg，水合氯醛可協助氯化鋇產生心律失常。氯化鋇多引起室性心律失常，可持續15分鐘。發生機制：Ba與Ca相似，過量引起興奮；Ba加快0相除極速率，並開放Na通道；與交感神經興奮有關。抗心律失常葯均可對抗Ba引起的心律失常。e.氯化鈣：普氏纖維對Ca敏感，而當心肌興奮時，普氏纖維則又抑制，使得心臟跳動不協調、分離，而發生心律失常；同時，Ca又興奮交感神經。可引起室性心律失常，但劑量難以控制，Vt與Vf劑量範圍小。觀察指標：是否出現心律失常，Vf或死亡，然後進行比較。f.哇巴因：引起心律失常出現快，多用犬、貓、豚鼠，靜脈給葯。給葯原則是先iv臨界量，然後每隔3分鐘注入一定量，直到心律失常。記錄：Vp出現的時間、容量；Vt時間、容量；Vf時間、容量；死亡時間、容量。對照組與給葯組分別以時間、容量進行比較。4. 抗心肌缺血實驗心肌梗塞病理模型是研究心肌缺血的一種方法,作為篩選抗心肌缺血藥物有如下規程。(1) 藥物篩選過程：l小鼠常壓或低壓耐缺氧實驗a.測氧儀測定動物死亡時氧餘存量或不同時間耗氧速率b.對抗異丙腎上腺素增加心肌耗氧量的作用比較c.生化指標：心、腦乳酸和糖原含量l對抗垂體後葉素引起的心電圖缺血改變l製造犬心肌缺血病理模型(2) 動物：l犬：優點：解剖特點類似於人的解剖犬的心臟占犬體重比例大犬的冠脈清楚，易於操作抗心律紊亂能力強缺點：犬心側枝循環豐富，如果條件不恆定會影響實驗結果。l貓、大鼠：價格便宜，但心律紊亂後易引起死亡。l兔：冠脈變異大，結果不一致。（3）心臟冠脈解剖學特點：冠脈分為：右冠脈左冠脈：左旋枝左前降枝(LAD)：供給左、右心室的一部分和室間隔2/3的血供，結紮LAD可致左心室前壁心肌梗死。（4）方法：◇ 結紮法：l 結紮部位： a. LAD上1/3處b. LAD的中點c. LAD的下1/3d. LAD和左旋枝的分支均結紮e. LAD的1/2和大的側枝結紮（優點：梗死範圍清楚、恆定；要求：LAD全長>6cm,大斜支>4cm）l 二步結紮法：以5-51/2的針頭插入動脈內結紮，30分鐘後拔出針頭，全扎。可防止心肌突然缺血，發生心律紊亂。l 一步結紮法：結紮前iv利多卡因8mg/kg，預防心律紊亂。l 心導管插入法：在心尖部做一荷包式縫合，用針將心肌穿透，插入心導管於心室內，導管內放入NS+肝素（1mg/ml）；另一端接換能器，測定心室內壓。l 觀察指標：缺血程度：∑ST和NST（範圍）缺血範圍：N-BT染色（氯化硝基四氮唑蘭）心外膜心電圖：S-T段抬高反映心外膜缺血S-T段下移反映心內膜缺血S-T段在6-7小時後恢復正常，故藥物應在1/2-1小時內給予，避免假陽性。血液動力學：a. BP(mBP)b. HRc.心肌耗氧指數=mBP x HRd.左心室內壓：LVPSP（收縮峰壓）反映心肌收縮力LVEDP（舒張末期壓）反映心肌灌流狀況生化指標：測定乳酸、GOT（穀草）、CPK（磷酸激酶）等酶的活性和O2、CO2。酶的活性增高與心肌梗塞的範圍是呈正比。心梗範圍（MIS）：作為藥物是否有抗心肌缺血的主要指標。a.國外在犬的心外膜上放置許多電極，以ST升高的個數作為梗塞範圍；b.CPK曲線（數學推導）c.組織化學染色法（N-BT染色）：非缺血區呈深藍黑色，缺血區呈灰白色，剪下缺血片稱重/左心室重量x100%，表示梗塞範圍。l 整個實驗過程：a.選狗：強壯、毛光亮，10kg以上，X光、心電圖檢查。b.麻醉：戊巴比妥鈉25-30mg/kgc.氣管插管d.左側第5肋間開胸e.結紮後觀察24小時，然後取出心臟。◇ 阻塞法：氣囊阻塞，水銀阻塞，微球法◇ 藥物模擬心肌缺血：l 垂體後葉素：動物選用清醒狀態大鼠。垂體後葉素→冠脈、全身血管收縮→阻力增加→血壓升高→心臟後負荷增加→心肌缺血觀察指標：ECG指標：J點，ST和T波變化注意：動物對垂體的耐受性，恆速給葯，同批葯。l異丙腎上腺素、腎上腺素：增加心肌耗氧量，心肌缺血。附表：表1. 動物心率、P-R間期及Q-T間期動物 心率（次 /分） P-R間期（秒） Q-T間期（秒）猴 150－273（x＝215） ♀0.079 ♂0.076 ♀0.21 ♂0.20狗 100－240（x＝159） 0.07－0.11（x＝0.089） 0.16－0.2（x＝0.175）兔 160-330 0.06-0.08 0.144±0.0038大鼠 x＝300 0.042±0.0005小鼠 x=400 0.043±0.0004表2. EKG的P波形態、時間及電壓動物時間（秒）方向電壓a a a 胸Ⅰ Ⅱ Ⅲ V V V 導R L R 聯標準導聯 肢體導聯 胸導聯（mv） (mv) (mv)猴0.03～0.04低 直 直 倒 倒 直 MV1-3平 立 立 置 置 立 無倒置或雙相0.12 向上0.10向下0.08狗0.03~0.05直 直 直 倒 倒 直 V1-3立 立 立 置 置 立 直立VR3-6倒置Ⅰ0.061 aVR0.122 V1 0.064Ⅱ0.194 aVL0.052 V3 0.081Ⅲ0.156 aVF0.151 V6 0.1121VR3 0.061兔0.03(0.02~0.04)大 全 全 全 大 全部 直 直 倒 部 直直 立 立 置 直 立立 立Ⅰ0.03 aVL0.05Ⅱ0.10 aVR0.06Ⅲ0.008鼠直立大Ⅱ0.083±0.2小Ⅱ0.0121±0.3表3. QRS波群動物時間（秒）電壓(mv)標準導聯肢體導聯 胸導聯猴0.037（0.035~0.041）QR 0.61S 0.250.410.41 Mv1 Mv2 Mv30.48 0.92 0.900.31 0.97 0.56 0.26狗0.0475（0.04~0.06）Ⅰ Ⅱ ⅢQ 0.108 0.07 0.066R 0.21 1.115 0.899S 0 0.093 0.126aVR aVL aVF v1 v3 v6 vR30.657 0.348 0.068 0 0 0.043 00.350 0.139 0.952 0.813 1.236 1.07 0.4140.612 0.30 0.115 0.589 0.39 0.193 0.68兔0.03Q 0.01 0 0R 0.13 0.35 0.33S 0 0.09 0.110 0.040.16 0.140.22 0.20小鼠0.022R 0.122大鼠0.023R 0.363S-T段：猴：Ⅰ導等電線； Ⅱ導、Ⅲ導和aVF是等電線或降低，而aVL、aVR呈等電線或升高，總平均偏移度為0.03mv左右；胸導聯S—T 段均為下降，總偏移度0.08mv,呈斜升型。狗：90%為等電線，10%下降或上升，呈斜升型<0.1mv.兔：偏移較少，4%Ⅲ導、aVF降低0.05mv；2%Ⅰ導、aVL抬高0.05mv，一般不超過0.1mv。鼠類：大、小鼠無明顯S-T 段。表4. T波猴波形Ⅰ Ⅱ Ⅲ aVR aVL aVF Mv1 Mv2 Mv3低 直 直 倒 倒 直 不 直 直平 立 立 置 置 立 定 立 立電壓0.17 0.17 0.13 0.13 0.14 0.11 0.35 0.35狗波形Ⅰ Ⅱ Ⅲ aVR aVL aVF v1 v3 v5 vR3低 直 直 倒 倒 直 直 直 直 直平 立 立 置 置 立 立 立 立 立電壓0.188 0.126 0.083 0.051 0.141 0.291 0.232 0.186 0.123兔波形Ⅰ Ⅱ Ⅲ aVR aVL aVF直 直 倒 不 直立 立 置 定 立電壓變異較大，0.05-0.4mv。鼠較難測量5. 降血脂動物實驗：（1）正常動物的初篩實驗：動物：大鼠、小鼠、雞、兔等；正常大鼠血清總膽固醇濃度約為：92.67±1.87mg%，若試驗藥物能降低大鼠血清總膽固醇20%，可認為有降膽固醇作用，值得進一步研究。（2）高血脂症動物模型：動物：大鼠方法：高膽固醇飼料（1~4%膽固醇，10%豬油，0.2%甲基硫氧嘧啶，86~89%基礎飼料）餵養，每天15~20g，持續2~4周，用於降血脂實驗。（3）高血脂及動脈粥樣硬化模型動物：兔方法：兔對高膽固醇飼養非常敏感，短期內能誘發明顯的病變。在飼料中加入高脂肪和高膽固醇後，主動脈斑塊發生率達100%，大約6周可以形成，用於觀察藥物的作用。測定指標：主動脈大體形態學觀察光鏡下觀察：內皮細胞增生腫脹，內皮下層增大和脂質沉著，並出現泡沫細胞。電鏡觀察：內皮細胞的完整性；分析內皮細胞間隙的改變。（4）動脈粥樣硬化的生化測定血清膽固醇、血脂蛋白、遊離脂肪酸；肝脂酶（HL）、脂蛋白脂酶（LPL）、卵磷脂膽固醇醯基轉移酶（LCAT）、HMG-CoA還原酶活性的測定；脂質過氧化物（LPO）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性測定；脂蛋白受體功能的測定：LDL受體的RIA測定。（5）細胞培養實驗血管內皮細胞培養：觀察內皮細胞形態，3H-TdR摻入測定，LDH測定。（6）有關因子及基因表達實驗血小板源性生長因子（PDGF）及c-myc mRNA與蛋白表達PDGF-B mRNA表達（二）中樞神經藥物實驗方法中樞神經有著龐大、複雜的結構特點和功能，如血腦屏障、各種結構不同功能各異的神經細胞、神經核團、腦區和多種神經遞質的調節。因此，神經系統疾病和治療藥物的研究存在一定的困難，在藥物研究過程中應該充分考慮到這些情況。下面僅就神經系統幾種常見疾病的藥物研究介紹一些方法。1. 抗癲癇藥物實驗（1）最大電休克發作實驗（MES）MES是癲癇大發作動物模型，受試藥若能對抗MES，則該葯在臨床上可能對癲癇大發作有效。l動物：小鼠或大鼠l儀器：電驚厥儀，刺激電極（耳電極或角膜電極），刺激參數：小鼠電流50 mA，電壓100v；大鼠電流150mA，電壓180v；刺激時間0.2-0.3s。l觀察指標：驚厥發展有四期，潛伏期、強直期、陣攣期、驚厥後期。以後肢強直性驚厥出現與否為準，若給葯後此期不出現說明此葯有抗MES作用。（2）聲源性發作法某些敏感動物受到強的鈴聲刺激時，能產生一種定型的運動性發作，稱為「聲源性發作，AS」。屬於癲癇大發作模型。l動物：大鼠或小鼠, 一般需培育純種AS陽性鼠，通過近親交配，至少超過20代，可得到純種AS陽性鼠，達到50％以上（北京醫科大學藥理室培育的P77-PMC鼠）。l方法：選擇聲源性敏感的大鼠（鈴聲刺激60秒或90秒能產生奔跑或驚厥者），放入聲源性發作箱，箱內裝有電鈴，產生的音量約為110－120分貝。當給予鈴聲刺激時，動物便開始奔跑，倒地、抽搐、驚厥。AS反應強度分為5級：1級 0分，陰性反應2級 10分 奔跑一次3級 20分 奔跑二次4級 30分 奔跑一次，驚厥一次5級 40分 奔跑二次，驚厥一次（3）戊四唑驚厥法戊四唑為中樞興奮葯，過量興奮和脊髓，表現強烈的陣攣行驚厥，繼續發展為強直性驚厥。l戊四唑發作閾值試驗（小發作模型）：小鼠，SC戊四唑85mg/kg，給葯後5－15分鐘內發作，頭部及前肢抽搐，但不影響翻正反射。每次可持續5－15秒，可反覆發作，少數動物可轉為強直性驚厥而死亡。藥物能夠防止發作，可視為有效。l戊四唑最大發作試驗（大發作模型）：將0.5％戊四唑生理鹽水，按38mg/kg於4秒內尾靜脈快速注射，動物即產生強直性驚厥或死亡。（4）點燃效應模型在腦內某些特定的區域受到經常的重複刺激，最終導致腦功能產生某種持久的變化，稱為「點燃效應」。用低電壓或小電流重複刺激大鼠的杏仁核，最終引起驚厥發作。目前是公認的做好的癲癇模型。l方法：大鼠麻醉。固定於立體定位儀，將電極埋藏於杏仁核。手術後大鼠休息一周，然後進行點燃。刺激條件是方形波電壓，波寬1毫秒，頻率60赫茲，刺激持續時間為2秒，每天刺激一次，刺激時間最好相同。刺激電壓從4伏特開始，每刺激2－3天後將電壓升高1－2伏特，每次刺激後注意觀察動物反應並做記錄，記錄內容包括：點燃日期、電壓值、動物的表現等。動物如有靜止不動、單側或雙側閉眼、轉頭、轉圈跑、嘴和面部肌的運動、點頭、前肢陣攣、站立、摔倒等陽性結果。大鼠產生典型發作後，其發作閾值立即下降，此時每天減少次級電壓，當降至某個電壓值剛好引起最大發作，連續刺激3天，該電壓的刺激既能得到穩定的點燃發作效應。此時可利用這個模型進行實驗。（5）機制分析方法癲癇發作機制複雜，目前並不知道確切的機制。但與腦內神經遞質、氨基酸、微量元素、神經細胞電活動異常、細胞信號傳導紊亂有關。l測定腦內GABA和谷氨酸含量及其合成酶和代謝酶的活性；l測定腦內各種神經遞質的水平；l測定cAMP/cGMP的水平；l測定腦神經細胞的電活動情況。2. 鎮痛葯實驗（1）熱板法（2）扭體法（酒石酸銻鉀，乙酸）（3）光照刺激甩頭法3. 促智葯和抗痴呆葯研究早老性痴呆症又稱阿爾采默病（Alzheimer disease, AD），AD的臨床癥狀主要是記憶障礙、認知功能缺失及痴呆。病理學特徵是腦中發現老年斑（senile plaque）、神經纖維纏結（neurofibrillary tangles）及選擇性神經元死亡。受影響的區域主要有大腦皮層、海馬、杏仁核、基底前腦膽鹼能系統及腦幹單胺類神經核團。AD的病因至今還未有結論性闡明，目前研究認為主要是腦神經細胞退行性病變機制如氧化應激機制、線粒體機能障礙機制、興奮性毒性機制、炎症機制及細胞凋亡機制等。它們之間相互影響，最終導致神經功能失調和細胞死亡。（1）對早老性痴呆動物模型的實驗研究：l對東莨菪鹼、D-半乳糖誘致動物學習記憶障礙的影響l對結紮動物雙側頸總動脈誘致血管性痴呆的影響l對大鼠或小鼠腦缺血再灌注損傷致學習記憶障礙的影響l對大鼠海馬內微量注射β-澱粉樣蛋白（Aβ25-35）建立的痴呆模型的作用l檢測方法：採用小鼠穿梭實驗，Morris水迷宮，跳台法，避暗法及自主活動的測定等方法。（2）對神經細胞退行性改變的啟動因子抑制作用的研究l對抗Aβ注射動物腦細胞凋亡的作用（觀測指標：DNA電泳梯度形成，bcl-2表達下調，bax、P53、C-fox表達上調及APP過度表達等）l抗氧化應激作用（腦細胞內nNOS、LPO、SOD、GSH-px酶活性的測定和脂褐素的測定）l抗炎性細胞因子的作用（測定腦細胞內IL-1、IL-4和IL-6的變化）（3）對AD發生相關酶活性的影響（檢測腦細胞內Ach-E，MAO，Na+,K+-ATPase的活性）（4）藥物對腦組織核酸代謝的影響（5）藥物對腦海馬細胞神經電活動的影響（採用膜片嵌技術）4. 抗抑鬱葯研究方法：（1）利血平拮抗：利血平耗竭腦內CA類遞質（NA、Adr、DA和5-HT），引起動物行為和生理上的變化，表現為：眼瞼下垂，體溫下降及強直癥狀。藥物能夠改善或拮抗上述癥狀，可能具有改善抑鬱的作用。（2）「行為絕望」模型：將動物（大鼠或小鼠）放入一定水深的裝置內，預試15min後，烤乾，重新放入，測定動物在該裝置內5min內漂浮不動的時間。評價藥物對其改善作用。（3）獲得性無助模型：動物可選用大鼠，將動物置於無法逃避的應激刺激（如電擊）時，將隨後產生操作欠佳，而在同等的可以逃避的應激刺激下則不產生操作欠佳。抗抑鬱葯可以逆轉。（4）腦內神經遞質變化的測定。（三）平喘藥物研究方法1. 鎮咳實驗：採用豚鼠枸櫞酸引咳法、貓二甲基苯基哌嗪引咳法，根據實驗結果分析藥物的鎮咳作用。2. 平喘實驗：選擇整體動物藥物引喘法，即將引喘藥物 0.1%組織胺和2%乙醯膽鹼以氣霧法給予豚鼠引起支氣管痙攣、窒息，觀察藥物的支氣管平滑肌鬆弛作用。3. 祛痰實驗： 小鼠腹腔注射0.25%苯酚紅溶液 0.7ml/只，30分鐘後將動物處死。分離氣管，以5%碳酸氫鈉沖洗3次（0.4ml/次），合併沖洗液進行比色，觀察藥物的祛痰作用。（四）潰瘍病藥物研究方法1. Shay幽門結紮型潰瘍：結紮幽門造成胃液在胃中滯留，致潰瘍因素增多，導致潰瘍形成。以潰瘍指數（根據潰瘍面積確定）評價藥物作用。2. 應激型潰瘍：應激刺激使中樞興奮和抑制過程失調，植物神經紊亂，迷走張力過高，胃肌強烈收縮，壓迫胃部血管，引起繼發性粘膜血運障礙，形成潰瘍。一般將大鼠放入冷水中（230C）浸泡7小時，處死動物，取出胃，測定潰瘍指數，進行比較。3. 損傷型潰瘍：大鼠麻醉後，打開腹部，暴露胃，採用乙酸注射法或乙酸塗抹法，使組織受損產生潰瘍。此模型多用於研究藥物對慢性潰瘍的治療評價。4. 藥物誘髮型潰瘍：消炎痛、阿司匹林、利血平、組胺等。（五）抗腫瘤藥物的研究方法1. 藥物體內抗腫瘤實驗：腹水瘤和實體腫瘤的接種，以生命延長率和腫瘤抑制率評價藥物的作用。2. 腫瘤細胞體外培養試驗法：（1）細胞排染試驗（台盼蘭染色法）（2）標記代謝物前體摻入法：標記氨基酸摻入蛋白質和標記胸腺嘧啶核苷、尿嘧啶核苷摻入核酸的測定。3. 利用分子生物學方法，研究腫瘤發生機制和抗腫瘤藥物的作用點。（1）拓撲異構酶（TOPO）抑製劑（2）微管蛋白活性抑製劑（3）胸腺嘧啶脫氧核苷酸合成酶(TS)抑製劑（4）以細胞信號轉導分子為靶點的抗腫瘤藥物（絲裂原活化的蛋白激酶（MAPK）信號轉導通路）（5）蛋白酪氨酸激酶（PTK）抑製劑（6）法尼基轉移酶(FTase)抑製劑（7）腫瘤新生血管生成（TA）抑製劑（8）端粒酶抑製劑（六）保肝藥物研究方法1. 四氯化碳肝鬱脾虛造型法：肝鬱脾虛是由於肝氣鬱結，蔬泄功能障礙，導致脾胃消化功能紊亂，出現脅痛、厭食、腹脹、大便溏泄、四肢倦怠等脾虛癥狀。四氯化碳中毒有類似情況，因為四氯化碳在內質網迅速被代謝為毒性產物（遊離基），使肝細胞膜發生過氧化作用而破壞。因此導致細胞內酶和電介質丟失，大量轉氨酶逸入血清。並進一步影響亞細胞結構。操作方法：l10％四氯化碳糠油溶液0.1ml/10g體重給予小鼠皮下注射，於實驗第1天及第6天注射，第8天處死動物觀察；l10％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g體重給予大鼠皮下注射，於實驗第1天及第4天注射，形成急性中毒，第6天處死動物觀察；慢性中毒以10％四氯化碳花生油溶液0.5ml/100g體重給予大鼠皮下注射，每周兩次，共四周，首劑加倍。l觀察指征：一般情況比較如活動情況、掙扎力、24小時進食量/只、體重增減、糞便硬度和顏色等；肝組織變化如肝細胞的松變、氣球樣變、脂變、壞死、再生等以及炎細胞浸潤、結締組織增生、肝竇擴大等。血清學測定SGPT的變化。2. D-氨基半乳糖法：D-氨基半乳糖肝損傷的病理變化與人類病毒性肝炎病理變化極為相似。它引起肝臟門脈區域的壞死和炎症浸潤，伴有康西耳曼氏體的有絲分裂和細胞增殖，以及枯否氏細胞數增加，SGPT升高，血清總蛋白降低。以此作為指標評價藥物的作用。3. 小鼠免疫性肝損傷模型：小鼠注射丙酸桿菌或卡介苗(BCG)後，再注射微量脂多糖(LPS)，可導致嚴重的肝損傷。實驗中可見血中GPT和GOT明顯升高，血清一氧化氮也明顯升高，肝臟病理檢查以肉芽腫性炎症浸潤為主。觀察藥物對這些指標的影響。（七）降糖藥物研究方法1. 鏈脲黴素(STZ)誘致糖尿病模型：STZ結構中的亞硝基脲是細胞毒。STZ 的α-異構體有較高的毒性,可能與B細胞膜上的葡萄糖受體有較高的親和力。STZ通過自由基損傷B 細胞，使細胞內胰島素合成受損，造成胰島素缺乏。l方法：將STZ溶於0.1mol/L檸檬酸緩衝液中，臨用前配製。大鼠常用量為60－80mg/kg(iv或ip)，小鼠為100－200mg/kg(iv或ip)。l結果：注射STZ後72小時，血糖可穩定升高，預測血糖在11.1mmol/L以上時可選用。給小鼠連續5天注射小劑量STZ（35－40mg/kg），1－2周後引起胰島炎。2. 四氧嘧啶（Alloxan）誘致糖尿病模型：Alloxan是胰島B細胞膜毒劑，通過產生超氧自由基而破壞B 細胞，使細胞內DNA損傷，並激活多聚ADP核糖體合成酶活性，從而使輔酶Ⅰ含量下降，導致mRNA功能受損，B 細胞合成前胰島素減少，導致胰島素缺乏。l方法：動物 劑量 (mg/kg) 途經犬 50－75 iv兔 150－200 iv大白鼠 150－200 ip大白鼠 40－60 iv小鼠 200 ip小鼠 85－100 ivl結果：注射Alloxan72小時後，血糖可穩定升高，預測血糖在11.1mmol/L以上者可選用。三、小結中藥藥理研究的方法很多，根據選擇的題目和要解決的問題確定合適的方法。但最重要的是選擇的方法一定要可靠、穩定和可操作性。實驗前的實驗設計非常重要，要三思而後行，避免悔之晚矣！這裡介紹的幾種實驗方法僅供參考，具體操作時還要查閱有關的書籍和文獻，並有必要的進行預實驗，掌握第一手資料。參考文獻：1. 李儀奎主編：中藥藥理實驗方法學. 上海科學技術出版社，19912. 張均田主編：現代藥理實驗方法（上、下冊）.北京醫科大學中國協和醫科大學聯合出版社，19983. 杜冠華等主編：藥理學實驗指南－新葯發現和藥理學評價.科學出版社，2001
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