【從RNA提取到qPCR】實時熒光定量PCR背景介紹

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【從RNA提取到qPCR】實時熒光定量PCR背景介紹

實時熒光定量PCR（realtime fluorescence quantitative PCR）是一種研究基因表達量的重要方法（以下簡稱為qPCR）。

qPCR的重要特點

qPCR基於PCR擴增反應，需要區分qPCR與普通PCR的重要差別。做普通PCR時會將得到的PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳，通過核酸染料的染色藉助於紫外凝膠成像儀進行觀察，最後通過終產物進行定性或者半定量分析（如圖一）；

圖一

而qPCR在反應體系中引入了熒光基團（染料或者探針），可藉助於對PCR產物進行標記跟蹤，實時在線監控反應過程，結合相應的軟體可以對產物進行分析，計算待測樣品模板的初始濃度（見圖二）。

圖二

由此可見，兩種方法的重要差別在於研究的對象不同，普通PCR關注終產物，qPCR關注起始模板。

熒光定量PCR儀器工作原理

qPCR儀器的品牌和型號很多，從原理上分析，包含以下三個反應模塊：激發光發射源，接收裝置，PCR反應模塊（見圖三）。

由於體系中引入了熒光基團，需要激發光發射源發出一定波長的光線，遇到熒光基團會反射另外一個波長的光線，此時被接收裝置實時接收，正是由於qPCR儀器比普通PCR儀器增加了這兩個模塊，因此，qPCR的耗材比普通PCR的耗材要求更高，其頂蓋的透光性必須良好。在做qPCR時要注意不要徒手或者戴乳膠手套接觸頂蓋，一定要佩戴PE手套操作，防止雜質留在頂蓋上影響熒光信號的發射及接收。

圖三

熒光定量PCR重要參數

qPCR有兩個重要的參數，第一個參數是擴增曲線。圖四為擴增曲線表示形式，橫坐標代表循環數，縱坐標代表熒光強度或者相對熒光強度。反應開始時，熒光信號不穩定，呈現波動狀態，隨後信號會趨於穩定並且呈現指數性增長，到達一定循環數之後，熒光信號強度不再增加，持續穩定。擴增曲線展現出來為一條S型曲線，包括：基線期，指數擴增期，平台期。反應完成後，qPCR儀會以基線期熒光信號標準偏差的10倍生成一條閾值線，閾值線與擴增曲線產生交點，交點對應的橫坐標代表Ct值，Ct值的含義代表每一個反應體系中熒光信號強度達到閾值時經歷的擴增循環數，其本質不難看出就是循環數，它是熒光定量中唯一用於後續計算的數值，是後續定量計算的基礎。

圖四

圖五同為擴增曲線，作者完成個96個獨立的qPCR反應，可以看出，儘管平台期不相同，但是在指數擴增前生成的閾值線，得到的96個Ct值幾乎一致，表明96個反應體系中模板量幾乎一致，體現了Ct值具有重現性這一重要特性，闡明以起始模板量為研究對象的qPCR定量是非常準確的，而以終產物為研究對象的普通PCR，因為經歷了整個PCR過程的指數性放大，其定量的準確性受到了限制。擴增曲線可以幫助判斷反應的完整性，完整的擴增應該包含之前介紹的三個時期。

圖五

第二個重要參數是溶解曲線。溶解曲線在反應完成之後進行檢測，反映溫度和熒光值之間的關係，只有染料法才可以進行溶解曲線檢測，探針法因探針水解後不能還原，故不能做溶解曲線分析。下面兩張圖都是溶解曲線，圖六為原始數據，可以看出，隨著溫度升高，DNA雙鏈會逐漸解開，結合的染料會釋放出來，因此熒光信號會逐漸下降，到達一定溫度範圍，熒光信號出現跌落，進一步升高反應溫度，因體系中均為單鏈DNA，故熒光值不再發生明顯變化。

圖六

對整個過程進行求導後，得到圖七展示的我們比較熟悉的溶解曲線圖，緩慢下降及最終的熒光信號穩定不再下降求導後為直線，急劇跌落求導後為峰值，因此一個峰對應一次熒光信號的跌落，每次跌落代表在這個溫度範圍內有一個雙鏈產物被大量解鏈，因此單峰代表只有一個特異產物，多於一個峰代表存在非特異擴增產物或者引物二聚體，溶解曲線幫助我們判斷的是反應的特異性。總結一下，通過擴增曲線和溶解曲線分析，只有完整而且特異的反應，Ct值才真實可信，才可以使用Ct值去進行後續的定量計算。

圖七

熒光定量PCR數學原理

要理解為什麼可以用循環數本質的Ct值去進行定量計算，必須基於一定的數學原理。定義初始模板量為X0，第n次循環之後產物量為Xn，理想PCR反應，Xn=X0×2n，非理想PCR，我們定義引物擴增效率為Ex，Xn=X0×（1+Ex）n，兩邊同時取對數，將Ct值和達到Ct時產物的量X(Ct)代入整理的公式，lg X0= (- lg(1+Ex) ) ×C(t)+ lg Xc(t)這個最終的方程表明初始模板濃度的對數與Ct值呈線性關係，正是線性關係的存在，所以我們可以用Ct值來進行後續表達量的計算，它是進行計算的基本數學原理。

熒光定量PCR國際標準

最後，推薦一篇發表在臨床化學上的文章，The MIQE Guidelines。它提出發表文章時所要求的最低限度的必要信息標準，同時文章對qPCR的術語、概念、研究與臨床應用、樣本的採集、處理和製備、核酸的質量控制、反轉錄、qPCR過程及數據分析等方面的操作標準和規範都做了詳盡的闡述。