【從RNA提取到qPCR原創系列四】qPCR背景介紹（下）

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上一期介紹了熒光定量PCR與普通PCR的重要差別、qPCR的兩個重要參數及數學原理，接下來繼續為大家梳理定量方式和定量方法等相關內容。

qPCR 的定量方式

qPCR常用的定量方式有：SYBR染料法、TaqMan探針法、分子信標。

SYBR染料法利用SYBR Green I分子的特點，SYBR Green I 是一種結合於所有雙鏈DNA（dsDNA）雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料（見圖一）。

圖一

SYBR Green I 只有和雙鏈DNA結合後才發熒光，遊離的染料分子不發光，在新合成鏈延伸過程中SYBR Green I 摻入雙鏈中，變性時DNA雙鏈解開，SYBR Green I 遊離出來，無熒光，過程參見圖二。SYBR染料法需要注意引物的特異性，因為非特異擴增產物和引物二具體均為dsDNA，所以SYBR染料法只能通過引物來保證特異性，SYBR染料法的優點在於簡單且成本較低；

圖二

TaqMan探針法核心是探針分子，TaqMan探針是單鏈DNA，5』端偶聯發光基團，3』端偶聯淬滅基團，遊離的完整探針是檢測不到熒光信號的，發光基團發出的熒光會被淬滅基團吸收淬滅，探針被水解，發光基團和淬滅基團遠離就可以檢測到熒光信號（見圖三）。

圖三

反應開始時，模板鏈經熱變性解鏈形成單鏈，TaqMan探針優先跟模板鏈退火，引物隨後退火到模板上，之後進行鏈的延伸，延伸過程中Taq酶發揮5』-3』外切酶活性，遇到探針會從5』端逐個鹼基切除探針，發光基團會跟淬滅基團分開，因此熒光檢測系統可以接收到熒光信號，每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，熒光信號的累積和PCR產物形成是同步的，整個過程參見圖四。TaqMan探針法的特異性除了由引物提供，更由探針分子保證，因其退火溫度更高，所以TaqMan探針法特異性更好，在一個反應體系中加入多條探針，可以做多個基因同時檢測。

圖四

分子信標類似於TaqMan探針，5』端偶聯有發光基團，3』端偶聯淬滅基團，遊離的探針因互補結構存在形成發卡結構，發光基團和淬滅基團距離非常近，發光基團發出的熒光會發生熒光共振能量轉移現象（FRET），激發淬滅基團後信號衰減（見圖五）。

qPCR反應開始的時候，因體系溫度升高，髮夾結構被破壞打開，分子信標莖環區跟模板鏈退火，發光基團跟淬滅基團分開，因距離較遠，因此不會發生FRET，所有可以檢測到熒光信號的變化，新合成鏈會將分子信標替換，脫離模板鏈的信標分子又重新形成發卡結構不再產生熒光信號，整個過程參見圖六。分子信標因背景熒光極低及其高的特異性可以做SNP檢測。

圖六

關於定量方式的選擇，一般情況下，在科研中，絕大多數定量會選擇便宜且方便的SYBR染料法，對於更嚴格的定量，可以選擇TaqMan探針法；在醫療檢驗中，優先選擇準確並且特異的TaqMan探針法。

除此之外以下方面可以作為參考：

SYBR染料法適用：特異性要求不是特別高的反應、分子數（拷貝數）超過1000的反應、探針實驗前進行預實驗、PCR條件非常成熟、無二聚體、無非特異擴增；

TaqMan探針法適用：特異性要求較高的實驗、多重PCR（標記不同的熒光基團）、SNP檢測、靈敏度要求較高的實驗 。

一步法 VS 兩步法

一步法和兩步法qPCR的區別在於：兩步法是先完成反轉錄，反轉錄引物為通用引物，後以cDNA為模板進行後續qPCR檢測；一步法是直接以RNA為模板，在一個反應體系中先完成反轉錄，反轉錄引物為基因特異性引物（GSP），然後直接進行擴增，得不到cDNA，見圖七。適用範圍的差別在於，一步法適合單個基因多個模板檢測；兩步法適用於多個基因少量模板檢測。

圖七

qPCR定量方法

定量方法包括相對定量和絕對定量，兩者的重要差異在於相對定量的結果是差異性的結果，涉及比較；而絕對定量的結果是一個具體數值，對於基因表達量而言是基因的拷貝數，不涉及任何比較。

? 相對定量首先需要確定一個內參基因，內參基因作用有檢測樣本材料中RNA是否降解、糾正樣本加樣的差異、校正cDNA合成速率差異及校正PCR抑製劑的影響，其本質作用是利用內參基因的Ct值對目的基因的Ct值進行均一化處理，常用的內參基因包括GAPDH、β-actin、18S rRNA，使用的時候需要注意其序列必須是物種本身的特異序列，雖然其比較保守，但不同物種也會存在鹼基差別。另外，相對定量需要確定參照物，因為涉及比較，參照物選擇不同，所得的定量結果可能完全相反，經常選擇的參照物一般是對照組或未處理組

相對定量實驗方法包括兩種重要方法：

1. ??CT Method：使用內參基因定量所研究樣品和參照樣品的目的基因。內參基因與目的基因可以同時反應，也可以單獨反應；

2. 雙標準曲線法：對每個樣品的內參基因和目的基因都做絕對定量，求出每個樣品中內參基因和目的基因的絕對數量，然後根據相對定量的基本公式來求出目的基因的差異表達。絕對定量需要由標準曲線建立Ct值跟拷貝數之間的關係，標準曲線由標準品生成，標準品可以是已知濃度的RNA、質粒或合成的寡核苷酸鏈生成，定量未知模板時標準樣品和未知樣品必須同時反應；

? 絕對定量首先需要建立Ct值和拷貝數之間的線性關係，即標準曲線，標曲需要由標準品生成，標準品中基因序列要與待測樣品中基因序列一致，從而保證引物在兩者中擴增效率完全相同，標準品來源可以是質粒，純化的PCR產物或者基因組DNA等。標準品在加樣時需要注意體積最好大於2微升，以減少標曲誤差，標曲是由不同梯度標準品生成，每個標準品梯度建立Ct值與拷貝數對數值之間的聯繫，落在標曲上的梯度點最好有5個及以上，至少3個點。標準品和待測樣品同時反應，將待測樣品檢測的Ct值代入標曲後即可換算出待測樣品中基因的拷貝數。

祝大家科研順利！