【豬群保健】豬圓環病毒病流行與防治進展

作者：於新友，李天芝，李 峰，等

豬圓環病毒(PCV) 是圓環病毒科、動物圓環病毒屬的成員。該病毒科是國際病毒分類委員會(ICTV) 第6 次學術報告會新命名的一個科，是目前已知能自行複製的最小的哺乳動物病毒。PCV可以分為PCV1 和PCV2 兩種血清型。PCV1 無致病性，但廣泛存在豬體內及豬源代細胞系，1974 年，Tischer 首次從PK-15 豬腎傳代細胞系中分離。PCV2 具有致病性，該病主要以進行性消瘦和多系統病理損傷為特徵，可引起斷奶豬和育肥豬生長緩慢、呼吸急迫、消瘦、貧血、出現黃疸現象，剖檢後發現有淋巴結腫大、肝硬變、多灶性黏液性氣管炎、間質性肺炎和腎炎，給養豬業造成相當嚴重的經濟損失。1991 年，在加拿大首次暴發該病，隨後，世界各國和地區都有該病的報道，並在患斷奶仔豬多系統衰竭綜合征(PMWS)、豬皮炎和腎病綜合征(PDNS) 等病豬體內分離到PCV2，並證明PCV2 與這些嚴重威脅著養豬業的疾病密切相關。目前該病毒引起了國內外獸醫界的廣泛關注。

豬圓環病毒（PCV）是一種小的均勻對稱的二十面體球形病毒、無囊膜、大小（17±1.3）nm。PCV1 的病毒結構蛋白為36 ku，而PCV2 的病毒結構核酸組成。PCV 在CsCl 中的浮密度為1.37 g/cm3，沉降係數為52 S，分子質量為580 ku。PCV 對外界的抵抗力較強，在pH 為3 的酸性環境中很長時間不被滅活。該病毒沒有囊膜，對氯仿等有機溶劑不敏感，在56 ℃或70 ℃氯仿處理一段時間，不被滅活。在高溫環境（72 ℃）也能存活一段時間。PCV 不具有血凝活性，不能凝集牛、羊、豬、雞等多種動物和人的紅細胞。

2 PCV 的培養

PCV 在原代胎豬腎細胞、恆河猴腎細胞BHK-21 細胞上不能生長，PCV2 可在Vero 細胞中繁殖複製，最初生長不佳，但隨著代次的增加，生長狀態逐漸變好。PCV 通常在PK-15 細胞內增殖，由於PK-15 細胞系中常污染有PCV1，且無論是PCV1 和PCV2都不形成CPE，所以在選擇用於PCV2培養的細胞時，必須事先進行檢測。

PCV 基因組為單鏈環狀DNA 分子。PCV1 基因組長度為1 758 或1 759 bp，而PCV2 為1 767 或1 768 bp。兩者之間僅有68% 的序列同源性，而PCV2毒株之間序列同源性均95% 以上。PCV基因組最驚人的特點就是出現互相嵌套的開放閱讀框(ORF)。計算機軟體預測PCV2 基因組中可能含有11 個開放閱讀框。PCV11 個ORF 中只有ORF1和ORF2 的長度超過600 bp。PCV1 和PCV2 的ORF1 和ORF2 大小几乎相同，其他9 個ORF 除了ORF9 和ORF10以外，PCV2 都比PCV1 小，PCV1 在ORF1、ORF2、ORF4、ORF5、ORF6和ORF10 編碼的蛋白中含有糖基化位點，而PCV2 僅在ORF1、ORF4 中含有糖基化位點。ORFl 和ORF2 為主要閱讀框，ORFl 編碼與病毒複製相關的Rep 蛋白，而ORF2 編碼病毒的主要結構蛋白，即病毒核衣殼蛋白（Cap），研究表明Cap 蛋白與PCV2 的免疫保護性有關。ORF1 變異較小，而ORF2變異較大。最近第3 個病毒基因ORF3被確定，ORF3 蛋白是一個高度保守的蛋白，在PCV2 各分離株之間氨基酸同源性達到95% 以上。其餘的比較小的ORFs 的功能尚不明確。

豬是PCV2 的天然宿主，各種年齡、不同性別的豬都可感染病毒，但以哺乳期和育成期的豬最易感，尤其是5 ～ 12周齡的仔豬，一般於斷奶後2 ～ 3 d 開始發病，急性發病豬群中，病死率可達10%，在疾病流行感染過的豬群中，發病率和死亡率都較低，如果並發或繼發細菌或病毒感染可使死亡率大大增加。加拿大是首次報道PMWS 的國家，但時至今日，多數農場的豬群中仍然只是散發，很少呈流行性發生PMWS，但是與PCV2 有關的PNDS、心肌炎和繁殖障礙綜合征等疾病正引起了人們更多的關注。在美國，PCV2 感染和豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬流感病毒引起的疾病相比較輕，發病慢而緩和，人們對PCV2 是否引起呼吸道疾病綜合征(PRDC) 這一問題仍存在異議。PCV2 感染10 ～ 12 周齡肥育豬，死亡率10% ～ 15%，淘汰率5% ～ 10%，哺乳豬死亡率不足2%。此外英國、法國、德國、義大利、北愛爾蘭、西班牙、紐西蘭、墨西哥、阿根廷丹麥、韓國、日本等均有本病的發生和報道。血清學調查表明，PCV2 感染廣泛，多數豬群血清陽性率為20% ～ 50%。在北美和歐洲豬群中，發病率占被侵襲豬群的5% ～ 10%，發病死亡率達100%，德國屠宰豬血清中抗體陽性率達85%，英國隨機採集的豬血清樣品中血清陽性率達80%。比利時對1985—1999 年不同類型豬血清樣品檢測表明，PCV2 陽性率達100%，郎洪武等應用ELISA 法對我國7 省市不同類型豬群559 份樣品進行檢測，總陽性率達42.9%，表明PCV2感染在我國豬群中普遍存在。我國豬群中PCV2 感染情況也不容樂觀。我國對PCV2 的研究始於1999 年底，有學者對我國部分豬群的流行病學調查發現豬群中廣泛存在PCV2 抗體。

5.1 滅活疫苗

採用人工培養大量繁殖免疫原性好的病原微生物，滅活、濃縮後按一定比例加入佐劑製成的疫苗，稱為滅活疫苗，該疫苗可由病原微生物的完整個體組成，也可由其某些片段組成。滅活疫苗具有無毒、無害、效果穩定的優勢。國內外對豬圓環病毒滅活疫苗的研究已取得了巨大進展。法國梅利亞公司研究、開發的PCV2 油包水乳劑滅活疫苗，在歐洲一些國家已註冊上市，免疫後備母豬經產母豬，仔豬可通母源抗體獲得保護，實驗和臨床證明，該疫苗有較好的效果，可減少感染、排毒，減輕臨床癥狀。國內現有3 種自主研發的豬圓環病毒常規滅活疫苗獲准生產上市，其中PCV2 滅活疫苗LG 株由哈爾濱獸醫研究所研製，該產品免疫應答快，效果好。另有南京農業大學研發的PCV2 滅活疫苗SH 株和北京大北農集團研製的PCV2 滅活疫苗DBN-SX07 株。

5.2 弱毒疫苗

採用抗原性好的無毒株、天然弱毒株或人工誘變的弱毒株製成的疫苗稱為弱毒疫苗，該類疫苗具有不少優點如接種數量少，可刺激機體產生細胞免疫、體液免疫和黏膜免疫，免疫效果好等，但也存在一些缺點如可能會發生毒力返強，儲存和運輸需在冷凍條件下，易失活，易被細菌污染等。Fenaux 等將PCV2 於PK-15 細胞上傳120 代， 結果120 代病毒比初代病毒滴度高出一個log 單位，同時，傳30 代後Cap 基因110 位脯氨酸變為丙氨酸(P110A) 並維持到120 代，此外191 位精氨酸變為絲氨酸(R191S)，突變毒株在豬體內的接種實驗表明，PCV2120 代病毒血症時間和豬血清病毒含量明顯低於第1 代，即PCV2120 代明顯致弱。也有人將PCV2 的ORF2 克隆到缺失ORF2 的PCV1 的骨架中，得到PCV1-2 嵌合型病毒。研究表明，該嵌合型病毒是減毒的，能刺激機體產生特異性免疫反應，可作為製備PCV 弱毒疫苗的優勢毒株，且具備不易發生毒力返強的優勢。

5.3 亞單位疫苗

只含有病原微生物的抗菌抗原成分，而不含有核酸，但能刺激機體產生特應性免疫應答的一類疫苗，稱為亞單位疫苗。付玉潔等為評價豬圓環病毒(PCV)2a/2b 兩種基因型病毒株及其重組Cap 蛋白(rCap) 之間的交互免疫，採用重組桿狀病毒表達的2 種Cap 蛋白(PCV2a-rCap 和PCV2b-rCap) 亞單位疫苗。免疫小鼠後進行攻毒，結果，以PCV2a 和PCV2b 各為指示病毒對病毒抗血清和rCap 蛋白抗血清進行交叉中和試驗，同型病毒株與同型血清的中和抗體效價均高於異型病毒株。病理觀察顯示，免疫鼠均未見明顯病理變化，攻毒對照鼠肺臟出現一定程度的病理損傷。劉丹等以重組桿狀病毒表達的重組PCV2-Cap 蛋白製備亞單位疫苗，免疫BALB/c 鼠測定其抗體、中和抗體。結果表明，該蛋白亞單位疫苗能夠提供良好的免疫保護效果，能夠有效誘導小鼠產生明顯的體液免疫應答。

5.4 核酸疫苗

構建含有外源抗原基因的重組質粒，免疫動物後，表達的特異性抗原蛋白通過與MHC- Ⅰ 類或MHC- Ⅱ 類抗原分子結合，刺激機體產生特異性免疫應答，該類疫苗稱為核酸疫苗，又名DNA 疫苗。Kamstrup 等為了進一步探索衣殼蛋白免疫預防的適用性，採用了pcDNA3.1/V5-His-TOPO 真核表達載體克隆了PCV2 的ORF2 基因，並證實了此質粒能夠在體外( 通過直接表達蛋白) 以及體內( 通過對小鼠用基因槍注射質粒，誘導小鼠免疫產生抗體)進行表達。免疫試驗結果表明，所構建的核酸疫苗均能誘導小鼠產生一定的體液免疫和細胞免疫反應。Aravindaram等用構建的含PCV2 ORFl、ORF2、ORF3 的3 種重組質粒單獨或聯合免疫小鼠，2 周后加強免疫，結果發現ORF2/3 與ORFl/2/3 這2 種質粒組合免疫後PCV2 病毒載量顯著減少，誘導產生的IFN-γ、TNF-α、GM-CSF以及PCV2 抗體水平均高於其他免疫組，小鼠的肺部病變也明顯減輕。史小紅等將重組真核表達質粒pcDNAORF1-ORF2 免疫小鼠，2 周后加強免疫， 同時設置pcDNA-ORF1、p c D N A - O R F 2 、p c D N A 3 . 1 - ( + ) 、PCV2 全毒疫苗和PBS 對照。結果表明，該重組質粒誘導產生PCV2 抗體水平與其他試驗組相比差異顯著。閆若潛等[15]將豬圓環病毒2 型（PCV2）ORF2/ 豬白介素-2(PoIL-2) 嵌合重組表達質粒(rpcDNA3.1/PCV2-1inker-PoIL-2) 免疫10 日齡健康仔豬，結果發現重組質粒對豬體的免疫和免疫保護效果顯著。

5.5 活載體疫苗

採用弱毒或無毒病原微生物作為表達載體，對其導入外源抗原基因，製成疫苗後，接種動物，誘導機休產生特異性免疫應答反應，這類新型疫苗稱為活載體疫苗。Wang 等將PCV2 ORF2克隆入E.coli/L.lac 分泌型穿梭表達載體pSEC:LEISS，構建了重組穿梭載體pSEC:LEISS-dCap，電轉化乳酸菌NZ9000，獲得能有效表達Cap 蛋白的重組乳酸桿菌，將該菌培養液經口灌喂對Balb/c 小鼠的生長發育沒有影響，無毒性作用，能夠誘發小鼠產生抗Cap蛋白的特異性IgG 抗體，刺激腸道黏膜淋巴組織對其產生黏膜免疫。Pei 等在PRRSV cDNA 克隆的ORFs1b 與2a插入2 個限制性酶切位點及1 個轉錄調節序列，將其改造成一個病毒載體，然後將PCV2ORF2 基因插入2 個限制性酶切位點間，由插入的轉錄調節序列啟動轉錄，轉染Marc-145 細胞獲得了P129-PCV 重組PRRSV，2 次免疫仔豬，首免後3 周內，母源抗體存在，抗體水平不斷下降，而二免後1 周，免疫豬產生了PCV2 特異性的抗體應答，結果表明PRRSV 能成功表達豬其他病原的免疫原性蛋白，並誘發特異性的免疫反應，可以作為表達外來病原的豬疫苗載體。宮婷等構建了表達豬圓環病毒2 型Cap 蛋白重組複製缺陷型人5型腺病毒，對重組腺病毒的分子生物學鑒定和在小鼠上的初步免疫試驗結果表明，重組腺病毒可介導Cap 蛋白在真核細胞中的表達，並且表達的靶蛋白具有較好的免疫原性，為進一步將其開發成新型PCV2 疫苗奠定了基礎。王子龍等利用NDV LaSota 弱毒疫苗株為活病毒載體，通過反向遺傳操作系統構建出表達PCV2Cap 的重組病毒(rLa-PCV2/Cap)，以及表達刪除核定位信號(NLS) 的Cap(CapΔ41) 的重組病毒(rLa-PCV2/CapΔ41)，並對外源蛋白的表達效果進行了檢測，為研究新型PCV2 疫苗奠定基礎。鈔安軍等將PCV2 ORF2 基因插入到PRV 通用載體pG 中，成功構建了重組病毒PGO，並用該重組病毒免疫6 周齡雄性小鼠並檢測分析了PGO 的免疫原性，結果表明，該重組病毒能有效抵抗PCV2 強毒攻擊。

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