近期大熱的RNA修飾m6A研究，竟然只需三步！

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如果要評2017年RNA領域最火熱的研究，m6A修飾一定榜上有名！這不，2017年還未過完，RNA m6A的研究就已多次登上nature, cell, cancer cell等許多著名雜誌，涉及領域從RNA翻譯效率到DNA損傷修復，從生長發育到腫瘤形成，m6A的影響力可見一斑。

然而，m6A的研究才剛剛開始，還有很多空白，還有很多值得探索的問題。小夥伴們是不是摩拳擦掌，躍躍欲試卻又不知關於RNA m6A的研究該從哪下手呢？不用擔心，跟著小又，只需三步，帶你玩轉RNA m6A修飾研究！

一圖看懂RNA修飾

磨刀不誤砍柴工，步入正題前，一幅圖讓大家了解什麼是RNA m6A修飾。

如上圖，m6A是mRNA上最豐富的甲基化修飾，指鹼基A第6位N原子上的甲基，主要存在於mRNA的CDS區和3『UTR區，影響mRNA的穩定性，翻譯效率，可變剪接和定位等。此外，長非編碼RNA以及microRNA等非編碼RNA也存在m6A位點。

RNA甲基化分子機制

RNA甲基化過程需要三類分子參與：Writers, Erasers和Readers。

Writers：在RNA加上甲基，介導RNA的甲基化修飾過程。干這活的是甲基轉移酶，最常見的分子是METTL3和METTL14，兩者可在體外和體內催化mRNA（和其他細胞核RNA）的m6A甲基化。WTAP是這種甲基轉移酶複合體中的另一個關鍵組分。

Erasers：將RNA上甲基去除，介導RNA的去甲基化修飾過程。FTO和ALKBH5可以去除mRNA（和其他細胞核RNA）上的m6A甲基化。

Readers：識別RNA甲基化修飾的信息，並參與下游RNA的翻譯、降解等過程。比如，YTHDC1可與mRNA上的m6A修飾，促進mRNA出核運輸與可變剪接。YTHDF1/YTHDF3識別m6A後可促進mRNA的翻譯，而YTHDF2與m6A的結合則會促進mRNA的降解。

RNA甲基化研究實例

接下來，以一篇今年初發表在cancer cell上的文章為例，帶大家解析m6A研究的三步套路。

由上文的m6A簡介可以看出，m6A由相應的蛋白酶完成，那麼，要研究m6A在某一體系中的作用，也要從m6A相關蛋白酶下手。研究者通過整理之前的RNA晶元數據，發現FTO(m6A去甲基化酶)在特定的急性髓系白血病中高表達，並且通過質譜檢測發現，在含MLL-AF9融合蛋白的白血病中，m6A的整體水平比對照組低。

那麼，FTO在特定白血病亞型中的高表達，是否是其發揮了癌基因的功能呢？通過構建穩定敲低FTO的細胞系，研究者在細胞實驗和動物實驗中證明，敲低FTO可以顯著抑制腫瘤細胞的增殖以及延長實驗小鼠的生存時間。

接下來，就是文章的重點和難點——FTO發揮癌基因作用的具體機制是什麼？關於機制的探索，這不僅是m6A研究的重點，相信也是每個課題都要面對的問題。幸運的是，FTO做為m6A的去甲基化酶，功能是相對確定的，要尋找FTO的具體作用機制，實際上是尋找FTO靶向的mRNA。

這裡不得不提到的是m6A-seq技術，該技術通過用m6A特異的抗體將含m6A修飾的mRNA從總mRNA中富集出來，再結合高通量測序技術，就可以知道哪些mRNA含有m6A修飾。

研究者通過對過表達FTO和正常樣品的m6A-seq測序，發現了一批在過表達FTO後m6A修飾減少的基因，然後結合普通RNA測序，發現這些m6A減少的mRNA在表達量上也發生了變化。

研究者從變化倍數以及基因本身的功能著手，最終鎖定了兩個基因：ASB2和RARA並認為它們是FTO最主要的靶標，並在western blot實驗以及雙熒光素酶實驗中得到了驗證。End。

文章解析到這，相信大家也已經看出了m6A研究的三步套路：

1.尋找m6A相關酶在某一體系（疾病）中的異常表達情況。鑒於mRNA的測序和晶元數據較全，建議大家從資料庫中尋找，比如cbioportal,oncomime和GEO datasets等。

2.細胞及動物的表型實驗。通過敲低和過表達該m6A修飾酶，檢測細胞的變化，包括細胞增殖，凋亡，衰老等指標。

3.通過m6A-seq和RNA-seq的結合，尋找m6A含量變化和RNA分子數量變化最大的mRNA。這部分工作對生物信息學的要求較高，好在已有部分測序公司可以提供相關的分析。

以上，大家是否感覺cancer cell的文章也不是很難呢？這篇文章的亮點在於第一次在腫瘤中系統地研究了m6A去甲基化酶FTO的功能，並建立了較完善的研究方法，對後人的研究啟發很大，也是一篇里程碑式的文章！

Q&A

現在，腫瘤中m6A的功能研究還有很多空白之處，小夥伴們看準了就趕緊下手吧！想到大家在研究中可能遇到的問題，小又在此先自問自答了。

1 我研究的領域是XX癌，但是翻遍了各大資料庫，都沒發現METTL3/FTO和ALKBH5等m6A相關酶有差異表達，怎麼辦？m6A是不是跟我無緣了？

回答：要想和這樣一個重要的RNA修飾擦肩而過，還真是挺難的。M6A甲基化酶在某一體系中即使沒有異常表達，也不能說它們沒有功能。

推薦這篇PNAS的文章，研究者通過閱讀m6A文獻，發現NANOG的mRNA有m6A修飾，而NANOG在乳腺癌中是一個非常重要的癌基因，猜測m6A是否會在NANOG介導的乳腺癌中發揮功能，並在通過實驗驗證了這一點。

2 除了m6A-seq外是不是還有其他RNA甲基化的檢測方法？

回答：對RNA甲基化的研究才剛起步，因此現在RNA甲基化的檢測方法並不多，大致有3種，除了m6A-seq之外還有miCLIP和SCARLET。

miCLIP是將含有m6A的RNA與相應抗體結合以後，通過紫外進行交聯，反轉錄得到的cDNA會出現突變或者截斷，這樣就可以指示m6A的存在。該方法的解析度為單核苷酸水平。

SCARLET則是通過結合位點特異性的RNA酶H、放射標記和TLC（薄層層析）的方法，對RNA甲基化修飾進行檢測，該方法是從單基因通量下檢測RNA的甲基化修飾。

3 套路太簡單了，想要做得更深，更有新意，該怎麼辦？

回答：欣賞你這樣的有志少年！推薦也是今年發表在cancer cell上的文章，研究者發現m6A去甲基化酶ALKBH5通過影響FOXM1的功能，在惡性膠質瘤中扮演癌基因的角色，並創造性的將近年來火熱的長非編碼RNA納入該研究，發現ALKBH5對FOXM1的選擇性去甲基作用是通過長非編碼RNA FOXM1-AS介導的。