如何提取植物組織的蛋白質？

1、植物組織蛋白質提取方法（summer）

1）根據樣品重量（1g 樣品加入3.5ml 提取液，可根據材料不同適當加入），準備提取液放在冰上。

2）把樣品放在研缽中用液氮研磨，研磨後加入提取液中在冰上靜置（3-4 小時）。

3） 用 離 心 機 離 心 8000rpm40min4℃ 或11100rpm20min4℃ 4）提取上清夜，樣品製備完成。

蛋 白 質 提 取 液 ：300ml 1）1Mtris-HCl（PH8）45ml 2）甘油（Glycerol）75ml

3）聚乙烯吡咯烷酮（Polyvinylpolypyrrordone）6g

這種方法針對SDS-PAGE，垂直板電泳。

2、植物組織蛋白質提取方法(summer) 三氯醋酸—丙酮沉澱法

1）在液氮中研磨葉片

2）加入樣品體積3 倍的提取液在-20℃的條件下過夜，然後離心（4℃8000rpm以上1 小時）棄上清。

3）加入等體積的冰浴丙酮（含0.07%的β-巰基乙醇），搖勻後離心（4℃8000rpm以上1 小時），然後真空乾燥沉澱，備用。

4）上樣前加入裂解液，室溫放置30 分鐘，使蛋白充分溶於裂解液中，然後離心（15℃8000rpm 以上1 小時或更長時間以沒有沉澱為標準），可臨時保存在4℃待用。

5）用Brandford 法定量蛋白，然後可分裝放入-80℃備用。藥品：

提取液：含10%TCA 和0.07%的β-巰基乙醇的丙酮

裂解液：2.7g 尿素0.2gCHAPS 溶於3ml 滅菌的去離子水中（終體積為5ml），使用前再加入1M 的DTT65ul/ml。

這種方法針對雙向電泳，雜質少，離子濃度小的特點。當然單向電泳也同樣適用， 只是電泳的條帶會減少。

3、組織：腸黏膜 （newinbio）

目的：WESTERN BLOT 檢測凋亡相關蛋白的表達應用TRIPURE 提取蛋白質步驟：

含蛋白質上清液中加入異丙醇：（1.5ml 每1mlTRIPURE 用量）

倒轉混勻，置室溫10min

離心：12000 g，10min，4 度，棄上清

加入0.3M 鹽酸胍/95％乙醇：（2ml 每1mlTRIPURE 用量）振蕩，置室溫20min

離心：7500g，5 min，4 度，棄上清重複0.3M 鹽酸胍/95％乙醇步2 次沉澱中加入100％乙醇2ml充分振蕩混勻，置室溫20 min

離心：7500g，5min，4 度，棄上清吹乾沉澱

1％SDS 溶解沉澱

離心：10000g，10min，4 度

取上清-20 度保存（或可直接用於WESTERN BLOT）

存在的問題：加入1％SDS 後沉澱不溶解，還是很大的一塊，4 度離心後又多了白色沉定，SDS 結晶？測濃度，含量才1mg/ml 左右。

解決：提蛋白試劑盒，另外組織大小適中，要碎，立即加2X BUFFER，然後煮5－10 分鐘，效果很好的。

4、植物材料：水稻苗，葉鞘，根（ynibcas）

1）200 毫克樣品置於冰上磨碎

2）加lysis buffer，離心，10000rpm，4 度，5min 取上清

3）重複離心5min

lysis buffer：urea np-40 ampholine 2-me pvp-40

5、蛋白質樣品製備（sigma）

秧苗蛋白質樣品的提取按Davermal 等（1986）的方法進行。

100mg 材料剪碎後加入10mgPVP-40(聚乙烯吡咯烷酮)及少量石英砂，用液氮研磨成粉，加入1.5 ml 10% 三氯乙酸（丙酮配製，含10mM 即0.07%β-巰基乙醇），混勻，-20℃沉澱 1 小時，4℃，15000 r/min 離心15 min，棄上清，沉澱復溶於1.5ml 冷丙酮(含10 mMβ-巰基乙醇)，再於-20℃沉澱 1 小時，同上離心棄上清，（有必要再用80％丙酮）含10 mMβ-巰基乙醇所得沉澱低溫冷凍真空抽干。

按每mg 乾粉加入20μl（可調）UKS 液[9.5 M 尿素，5mM 碳酸鉀，1.25%SDS，0.5%DTT( 二硫蘇糖醇)，2% Ampholine (Amersham Pharmacia Biotech Inc，pH3.5-10)，6% Triton X-100]，37℃溫育 30min，期間攪動幾次，28 度（溫度低， 高濃度的尿素會讓溶液結冰）16000 r/min 離心15 min，離心力越大時間長一點越好！上清即可上樣電泳。或者-70 度保存。

6、植物根中蛋白質的抽取（phenol）

(1) sample, 液氮研磨

(2) 裝1.5 ml centrifuge 用tube

(3) 加1M KH2PO4+K2HPO4 700 ul

(4) 12000 rpm, 4 度, 10-15minite

(5) 取上層液，蛋白質就在裡面

7、材料：細菌蛋白（puc18）

用甲醇提取的，凍干後用緩衝液溶解的。樣品緩衝液是一般的。其中含又2%的SDS，20mmol 的2-巰基乙醇。