10步填上免疫組織化學 (IHC) 的坑

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文/半夏

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免疫組織化學 (Immunohistochemistry，IHC) 或免疫細胞化學(Immunocytochemistry, ICC) 是利用抗原與抗體特異性結合的原理，通過化學反應使標記抗體的顯色劑顯色來確定組織細胞內抗原（多肽和蛋白質），對組織切片或細胞標本中的某些多肽和蛋白質等大分子物質進行原位定性、定位或定量研究的實驗技術。

總體來說IHC的實驗流程和方法並不難，但做出漂亮的染色結果卻不那麼容易，在IHC實驗中許多細節也也值得注意。那麼細節主要是哪一些呢？且聽我一一道來。

1、標本固定

固定（Fixation）是使用化學試劑處理組織或細胞，的目的除了使細胞內的蛋白質凝固，減少或終止內源性或外源性細胞內分解酶的反應，防止組織細胞自溶，更是為了保存組織或細胞內的抗原性，使抗原不失活，不發生彌散。較好的固定劑具有滲透性強；其次不能使組織發生過度收縮變形；還需使組織得到一定的硬度，有較好的折光度。

固定劑多種多樣，例如無水酒精對糖原保存較好，容易使細胞收縮，其性能與95%酒精相似，很少單獨使用，一般只用於糖原的固定不同的抗原對固定液耐受程度不同。丙酮為易揮發的無色液體，有刺激性氣體。可使蛋白質沉澱，滲透性強，細胞收縮嚴重，對核的固定差廣泛用於酶組織化學中的各種酶的固定，也有人用於抗原的保存，作為細胞塗片免疫組化的固定液。

此外，有些固定劑對特殊組織有更好效果，如苦味酸對於頭皮、指甲固定有軟化效果，戊二醛（含有兩個醛基，具有很強的交聯作用）常用於電鏡標本的固定，使用濃度為2.5%，PLP固定液（Periodate-lysine-paraformaldehyde，由過碘酸、賴氨酸和多聚甲醛混合組成的磷酸鹽緩衝液）對於含糖組織抗原保存更好。如上所述我們需要根據實際情況選擇合適的固定劑。

目前常用的固定劑有中性甲醛液（甲醛飽和水溶液稱為福爾馬林），4%多聚甲醛-磷酸鹽緩衝液。多聚甲醛固定效果溫和，廣泛應用於免疫組織化學研究。甲醛能夠以固體的形式存在，即白色粉末狀的多聚甲醛。將多聚甲醛溶於PB，加熱至60℃（加熱可使多聚甲醛解聚為單體，必要時可滴加少量NaOH促進其溶解），加熱攪拌至液體透明為止。

固定方法多種多樣，常用的有浸透法、灌注法、原位法、滴片法、蒸汽法、微波法等，其中以浸透固定和灌注固定效果最好。灌注固定中將灌注針插入主動脈內是灌注固定的關鍵，也是難點。首先準確找到主動脈，這是此步驟的要點。可用溫生理鹽水將胸腔內的血液沖洗乾淨，用眼科鑷子輕輕夾住心外膜（夾的越少越好，以免影響取材）將心臟向左上方提起，即可看清主動脈，又可使灌注針很容易地插入主動脈內。

插入時動作要慢，針尖方向不要偏向右側，以免刺入右心房，如果感到有阻力，則將針退後、調整方向重新進針，直到進入主動脈，灌注針進入主動脈後可在心臟的上方看到其位置，灌注針進入主動脈的長度最好為3-5毫米。網上有很多方法學網址在此推薦給大家：

Journal of Visualized Experiments：

https://www.jove.com

Bio-protocol：

https://bio-protocol.org

Nature Protocols ：

https://www.nature.com/nprot/

Protocol-online:

http://www.protocol-online.org/

2、脫水、石蠟包埋和製片

脫水是指使用脫水劑置換組織中的水分使標本內處於無水狀態，具體是用梯度乙醇(由低到高)充分脫水，對於一些易脆的組織（如脾、肝臟等）應減少高濃度酒精里的停留時間，透明的時間也應該控制縮短。

對組織浸蠟時，一般選用56℃-58℃熔點的石蠟，石蠟液與標本的比例應該為（20-30）：1，浸蠟溫度最好不超過60℃，防止抗原的損失。

包埋是指將已浸透石蠟的組織塊置入包埋模具內，包埋應選好角度動作迅速，以便切片時有完整的切面。切片時則要該快則快該慢則慢，及時檢查刀片是否出現缺口，最好使用新刀片以防止蠟帶出現劃痕。包埋後需要快速冷卻，使標本與石蠟在短時間內凝聚成密度一致的一個整體。

3、脫蠟和水化

切片分別在二甲苯中10-15分鐘以脫掉組織中的石蠟，使組織恢復到固定後的正常狀態暴露出抗原以方便與一抗結合。若脫蠟和水化不全易出現局灶性反應和浸洗不全，而產生非特異性背景著色。脫蠟的效果主要是取決於切片的厚度、二甲苯的溫度、脫蠟時間，或移入恆溫箱加熱脫蠟。

水化的目的是為了洗去溶解的石蠟和二甲苯。二甲苯屬於非水溶液的有機溶劑，進入組織中的二甲苯不能與水溶性染色液相溶，需要通過梯度乙醇把組織中的二甲苯逐步替換出來，使標本切片從無水狀態順利進入染色液中進行染色反應。

4、抗原修復

抗原修復是指暴露抗原被封閉或隱藏的表位，恢復其原有的空間狀態，提高抗原陽性檢出率的過程。由於組織在甲醛或多聚甲醛固定過程中，發生了蛋白之間交聯及醛基的封閉作用，從而掩蓋抗原決定通過抗原修復，使得細胞內抗原決定族重新暴露，提高抗原檢測率。

常用的修復方法從強到弱一般分為三種，高壓加熱修復、微波修復、胰酶修復。其中高壓加熱修復這一方法簡便易操作，效果也更好。

胰酶消化修復法主要用於細胞內的抗原修復。使用0.1%氯化鈣（pH 7.6）製成0.05%-0.1%胰酶液，37℃孵育切片15-30分鐘，陳片應當適當延長時間。

使用高壓加熱修復對於修復溫度（92-98℃以上）和時間的把握十分重要，溫度越高修復時間越短，溫度與修復時間呈負相關。修復結束後注意室溫冷卻，讓蛋白自然復性。其次，盡量使用過量的抗原修復液，防止高溫液體揮發乾涸，對切片造成不可逆的損傷。

5、滅活內源性過氧化物酶和生物素

在傳統的親和素-生物素-過氧化物酶複合物法（ABC法）和鏈霉親和素-過氧化物酶法（SP法）中，免疫組化反應容易受到內源性過氧化物酶和生物素的干擾，必須用過氧化氫和卵白素等進行滅活和封閉。滅活內源性過氧化物酶一般用3%過氧化氫滅活約10分鐘左右，用甲醇配製過氧化氫更適合於保護抗原和固定組織。

6、血清封閉

與免疫熒光技術一樣，使用10%與第二抗體同種屬都的正常血清進行封閉，目的為了防止一抗與組織的非特異性結合，造成假陽性。

7、一抗和二抗濃度和孵育時間

不同的一抗濃度根據抗體說明書而定，孵育時間和溫度等對染色結果往往有著較大的影響。在4℃下，反應緩慢，背景較淺，推薦使用。二抗一般室溫孵育30分鐘。如何選擇一抗呢？

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8、切片清洗

PBS洗滌是為了去除未反應的抗體和其他雜物，以減少非特異性反應引起的背景著色和雜物污染，因此應該充分洗滌，特別是一抗孵育後。一般使用PBS洗滌3次，每次5分鐘。

9、DAB顯色

DAB顯色液（3,3』-二氨基聯苯胺）終產物為棕黃色或棕褐色，為免疫組化最常見的的顯色液。DAB顯色的棕黃色色原穩定性好，不溶於有機溶劑，可長期保存而不褪色。背景的深淺和特異性染色的深淺都可以由DAB孵育條件決定。DAB顯色時間不是固定的，主要由顯微鏡下控制顯色時間，到出現特異性染色較強而背景著色較淺時即可沖洗。

DAB顯色時間很短(如幾秒或幾十秒)就立即出現很深的棕褐色，這可能說明一抗濃度過高，需要適當下調抗體濃度；若很短時間就出現深背景，有可能非特異性蛋白封閉不全，需要延長封閉時間；DAB顯色時間很長(如超過10分鐘)才出現陽性染色，可能是一抗體濃度過低或者封閉時間過長。貼片後梯度酒精脫水透明中性樹脂封片後拍片即可。

10、免疫組化圖片分析

常用的圖像分析軟體可對組織化學和細胞化學染色結果結果進行定量分析。常用的圖像分析軟體有OSIRIS/GSA Image Analyser、Imagej、Image Pro Plus（IPP）等。Imagej是美國NIH開發的一款在生物醫學中應用十分廣泛的免費軟體，下載地址為https://imagej.nih.gov/ij/ 。該軟體的顯著優勢是開源、免費，不受電腦系統（官網提供適用不同操作系統的版本）的限制且功能強大。給大家分享一個基於Imaegj的免疫組化圖片分析神器：IHC Profiler。

IHC Profiler插件免費下載地址：https://sourceforge.net/projects/ihcprofiler/。