Cell Stem Cell丨胡寶洋/周琪/李偉合作組突破哺乳動物同性生殖障礙，首次獲得孤雄小鼠——李勁松點評

點評丨李勁松（中科院生化細胞所）

責編丨迦漵

同性生殖

（unisexual reproduction）

的現象在動物中並不罕見，例如在爬行類的蜥蜴，兩棲類的蛙，以及多種魚類中，都有「孤雌生殖」現象：即不經過與雄性的交配，雌性個體即可生下後代

【1】

。作為有性生殖的補充，

孤雌生殖

（gynogenesis）

能在缺乏雄性的情況下，維持個體的繁衍與種群的更新。與孤雌生殖對應的孤雄生殖則極其罕見，迄今只在一種斑馬魚中發現孤雄生殖。然而

對於高等哺乳動物，無論孤雌生殖或孤雄生殖都不存在。

科學家們人工構建出的孤雌或孤雄胚胎均在發育早期死亡。

在爬行類和兩棲類不存在、而在哺乳類進化出來的印記基因

被認為是阻礙哺乳動物同性生殖的重要因素

。

早在上世紀80年代，以德國馬普所的

Davor Solter

和劍橋的

Azim Surani

為代表的科學家差不多在同一時間通過核移植實驗證明了只有同時具備雙親染色體的胚胎才能存活，而含有兩份父源基因組

（biparental gynogenones）

或者兩份母源基因組

（biparental androgenones）

的胚胎則不能完成正常的胚胎髮育

【2】

，這表明父源和母源基因組對於胚胎髮育的貢獻存在較大的差異性，首次提出了印記基因（imprinted genes）的概念

【3】

（因為對印跡基因領域的傑出貢獻，Davor Solter和Azim Surani共同獲得2018年度加拿大蓋爾德納獎，Canada Gairdner Award）

。

據統計，目前已經發現的印記基因超過100個

【4】

，隨機分布於染色體的數十個區段上，表達模式由印記控制區段的差異甲基化來控制。東京農業大學Kono實驗室曾在未成熟卵中刪除了2個印記控制區段，成功得到了活的孤雌小鼠，首次實現了哺乳動物的孤雌生殖

【5，6】

，曾引起廣泛關注。然而許多新的科學問題也隨之而來：

為什麼在眾多印記區段中，僅僅改變兩個即可實現孤雌生殖？這些孤雌小鼠為什麼有發育缺陷？孤雄生殖有可能在最高等的哺乳動物中實現嗎？

10月11日，中科院

動物研究所

胡寶洋

研究員與

周琪

院士、

李偉

研究員組成的聯合研究團隊在

Cell Stem Cell

雜誌上發表了題為

Generation of Bimaternal and Bipaternal Mice from Hypomethylated Haploid ESCs with Imprinting Region

的研究論文，結合單倍體幹細胞技術和基因編輯技術對上述問題進行探索，

首次獲得具有兩個父系基因組的孤雄小鼠

，具有十分重要的意義

。

該研究團隊首先發現，由卵細胞建立的孤雌單倍體幹細胞，在高代次條件下，刪除與Kono實驗室相同的兩個印記區段並注射進第二個卵細胞後，同樣能發育得到「兩個母親」的孤雌小鼠。進一步研究發現，

高代次的孤雌單倍體細胞展現出了一種不同於卵子或較低代次細胞，反而類似原始生殖細胞的全基因組甲基化模式，且所有的印記區段都呈現出類似原始生殖細胞的「無印記」狀態

。這揭示了為何 「僅僅刪除2個」印記區段，就能獲得孤雌小鼠：實際上，所有繼承自卵細胞的印記基因，在孤雌單倍體幹細胞中都經歷了印記模式的「重新修正」。與此結果一致的是，研究人員發現在孤雌小鼠中，除了一個印記基因

(Rasgrf1)

表達顯著異常之外，其他所有印記基因都與正常小鼠無異。

利用單倍體幹細胞易於基因編輯的特性，研究人員在孤雌單倍體幹細胞中同時刪除了包含Rasgrf1在內的三個印記區段。發育結果證實，Kono獲得的孤雌小鼠的多種缺陷，確實是Rasgrf1的異常所導致的：人們首次獲得了在發育、行為、代謝和生育力上均與正常小鼠無異的孤雌小鼠。更令人驚訝的是，

在由精子建立的孤雄單倍體幹細胞中，同樣發現了類似原始生殖細胞的甲基化模式。

這意味著，在低等脊椎動物中罕見的孤雄生殖，有可能在哺乳動物中實現。

研究人員在孤雄單倍體幹細胞中，篩選並最終刪除了7個重要的印記控制區段

（Nespas，Grb10，Igf2r，Snrpn，Kcnq1，Peg3，Gnas）

。這些細胞與另一顆精子所形成的孤雄胚胎幹細胞，發育成為了活的孤雄小鼠。這些孤雄小鼠外觀正常，可以自主呼吸，但是都在出生後48小時內死亡。這是

首次獲得具有兩個父系基因組的孤雄小鼠，證實了即便在最高等的哺乳動物中，孤雄生殖也有可能實現。

總的來說，該項研究利用單倍體胚胎幹細胞技術作為平台，系統證明了哺乳動物中跨越同性生殖障礙需要經歷的三步：

1、單倍體幹細胞展現出類似原始生殖細胞的「無印記」模式；2、在單倍體干細中對特定印記區段進行修飾，建立新的印記模式；3、結合卵母細胞注射或四倍體囊胚補償技術獲得孤雌或孤雄動物

。該研究也證實了，更完善的印記修飾能夠完全跨越孤雌生殖障礙，獲得健康發育的孤雌動物。

得到孤雄小鼠需要更多的印記修飾，而所有的孤雄小鼠均無法存活至成年，意味著相比孤雌生殖，孤雄生殖有著更多的障礙

。這些發現對理解基因組印記的進化、調控和功能具有重要意義，對於開發新的動物生殖手段也有重要價值。

據悉，該研究工作由中國科學院動物研究所和中國科學院幹細胞與再生醫學創新研究院完成。中國科學院動物研究所

胡寶洋

研究員、

周琪

研究員和

李偉

研究員為論文的共同通訊作者；博士後

李治琨

、

王樂韻

、博士生

王立賓

、

袁雪薇

以及

馮桂海

副研究員為共同第一作者。

參考文獻：

1、Neaves, W. B., & Baumann, P. (2011). Unisexual reproduction among vertebrates.

Trends in Genetics

, 27(3), 81-88.

2、

McGrath, J., & Solter, D. (1984). Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes.

Cell

, 37(1), 179-183.

3、Surani, M. A. H., Barton, S. C., & Norris, M. L. (1984). Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis.

Nature

, 308(5959), 548-550.

4、Barlow, D. P., & Bartolomei, M. S. (2014). Genomic imprinting in mammals.

Cold Spring Harbor perspectives in biology

, 6(2), a018382.

5、Kono, T., Obata, Y., Wu, Q., Niwa, K., Ono, Y., Yamamoto, Y., ... & Ogawa, H. (2004). Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood.

Nature

, 428(6985), 860.

6、Kawahara, M., Wu, Q., Takahashi, N., Morita, S., Yamada, K., Ito, M., Ferguson-Smith, A.C., and Kono, T. (2007). High-frequency generation of viable mice from engineered bi-maternal embryos.

Nat. Biotechnol.

25,1045–1050.

專家點評

李勁松

（中科院生化與細胞所研究員）

印記基因對於高等哺乳動物的胚胎髮育發揮重要的調控作用

【1】

。上世紀80年代，Surani教授團隊通過構建小鼠單親二倍體胚胎的方式證明父源DNA拷貝和母源DNA拷貝在遺傳上的不等價性

【2】

。其不等價性的重要原因是不同來源的DNA拷貝攜帶著不同的甲基化修飾，這些攜帶修飾的區域使其周圍基因發生等位基因之間的差異性表達

【3】

。

2007年，Kono教授團隊通過在未成熟卵母細胞中敲除H19-Igf2和Dlk1-Dio3兩個印記基因簇的調控區域並與成熟卵母細胞融合後成功獲得了能夠存活的孤雌小鼠，實現了孤雌生殖，相對完整地詮釋了父源高甲基化印記基因簇在小鼠胚胎髮育過程中的作用

【4】

。

而孤雄生殖一直以來都有實驗室在嘗試，但是並沒有獲得很大的突破，其重要原因是母源高甲基化印記基因簇數量眾多

。目前所知，小鼠印記基因簇超過23個，其中父源高甲基化印記基因簇只有3個，絕大多數為母源高甲基化印記基因簇

【5】

。所以，

研究母源高甲基化印記基因簇對於胚胎髮育的貢獻需要高效的基因編輯工具。

2016年，胡寶洋研究員團隊和我們課題組在Cell research雜誌上同期報道

【6】

【7】

，將H19-Igf2和Dlk1-Dio3印記基因簇調控區域敲除的孤雌單倍體胚胎幹細胞注射進MII的卵母細胞中可以穩定獲得出生的小鼠，證明了單倍體胚胎幹細胞進行印記基因簇調控區域敲除可以有效地模擬精子的印記狀態。

在本文中，胡寶洋研究員團隊及其合作團隊以單親生殖為出發點，利用單倍體胚胎幹細胞為工具，在敲除H19-Igf2和Dlk1-Dio3兩個印記基因簇的基礎上，進一步發現了敲除Rasgrf1印記基因簇可以提升孤雌胚胎的發育狀態，補充了父源高甲基化印記基因簇對於胚胎髮育的貢獻；並且通過對孤雄單倍體胚胎幹細胞七個母源高甲基化印記基因簇調控區域的敲除成功地代替了卵子遺傳物質，獲得了出生的孤雄小鼠，實現了孤雄生殖，為研究母源高甲基化印記基因簇對於胎兒發育的貢獻奠定了重要基礎。而

本文中攜帶多調控區域敲除的重構胚胎並不能直接發育到期，需要通過四倍體補償的方式發育到期，說明與胎盤相關的母源高甲基化印記基因簇在胚胎髮育過程中發揮的作用還有許多未知內容有待探索。本研究顯示，單倍體胚胎幹細胞作為配子替代物構建胚胎的研究體系為胚胎髮育調控研究提供了新工具。

參考文獻：

【1】Mary A.M. Cleaton, Carol A. Edwards,, and Anne C. Ferguson-Smith（2014）Phenotypic Outcomes of Imprinted Gene Models in Mice: Elucidation of Pre- and Postnatal Functions of Imprinted Genes.

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t..15:93-126.

【2】Surani M.A.H, Barton S.C,Norris M.L（1984）Development of reconstituted mouse eggs suggest imprinting of the genome during gametogenesis

. Nature.

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【3】Ferguson-Smith, A.C., Sasaki, H., Cattanach, B.M. & Surani, M. A. (1993) Parental origin specific epigenetic modification of the mouse H19 gene.

Nature

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【4】Kawahara, M., Wu, Q., Takahashi, N., Morita, S., Yamada, K., Ito, M., Ferguson-Smith, A.C., and Kono, T. (2007). High-frequency generation of viable mice from engineered bi-maternal embryos.

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. 25,1045–1050.

【5】http://www.mousebook.org/mousebook-catalogs/imprinting-resource

【6】Li, Z., Wan, H., Feng, G., Wang, L., He, Z., Wang, Y., Wang, X.J., Li, W., Zhou, Q., and Hu, B. (2016). Birth of fertile bimaternal offspring following intracytoplasmic injection of parthenogenetic haploid embryonic stem cells.

Cell Res.

26, 135–138.

【7】Zhong C, Xie Z, Yin Q, Dong R, Yang S, Wu Y, Yang L, Li J. (2016) Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection. Parthenogenetic haploid embryonic stem cells efficiently support mouse generation by oocyte injection.

Cell Research

.26, pages131–134.

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