做實驗 | 最 炫 實驗結果圖~流式細胞術高手必備！

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流式細胞檢測

利用流式細胞儀，以高能量激光照射高速流動狀態下被熒光色素染色的單細胞或微粒，測量其產生的散射光和發射熒光的強度，從而對細胞的物理、生理、生化、免疫、遺傳、分子生物學性狀及功能狀態等進行定性或定量檢測的一種現代細胞分析技術。

可檢測的樣本：

a.各種細胞（如外周血，骨髓，細針穿刺，灌洗液，實體組織，懸浮或貼壁培養的細胞），微生物，人工合成微球等；

b.血清、血漿、培養上清、細胞裂解液；

流式檢測細胞凋亡

樣品處理：

1.取對數生長期細胞，胰酶消化；

2.終止消化反應，同時吹打使細胞完全分散，離心棄上清；

3.PBS洗2次，加結合緩衝重懸，調整細胞濃度為1×106個/ml；

4.取4支流式管，每管加100 μl細胞懸液，並編號1、2、3、4；

5.2號管加入5 μl Annexin V-FITC，3號管加入 5 μl PI，4號管分別加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI輕輕混勻；

6.室溫(20-25℃)避光孵育 15 min；

7.每管加 400 μl 結合緩衝液；

8.300目（孔徑40-50 μm）尼龍網過濾，1 h 內上機檢測。

上機檢測及數據處理：

常見問題

Q1.無法標記

(1).確保所有的抗體都按照廠商的說明書正確存儲。

(2).確保商品化抗體沒有超過有效期。

(3).確保已正確加入足量的抗體。

(4).確保抗體已連接熒光素。如果未連接熒光素，需加入連接有熒光素的二抗。

(5).確保二抗是好的，也就是說二抗曾經能與另外的一抗成功結合。

(6).確保使用了正確的二抗，就是說二抗能夠識別你的一抗。

(7).如果使用的是PE或APC熒光素的抗體，確保該抗體未被冰凍過。

(8).你要檢測的組織上是否表達該抗原？可查看相關文獻了解該抗原的表達情況，或者同時做一個陽性對照。

(9).抗體是否能識別檢測物種的抗原位點？可檢查抗體的交叉反應列表（例如http://www.biolegend.com/cross_reactivity），看看抗體是否適用於你要檢測的物種標本。不是所有的抗體都能夠檢測所有物種相應抗原。

(10).確保使用正確的激光來激發熒光素，並使用了正確的通道來檢測該熒光。

Q2.PE抗體無法標記，而FITC抗體的結果卻很好

(1).PE熒光素可能冰凍過。如果冰凍過，建議另外買一管新的抗體。

(2).多聚甲醛（PFA）可能會導致此問題。PFA降解後可釋放出甲醇，從而影響染色。所以切記PFA儘可能新鮮配製，或者細胞儘可能不要固定，染完色就立即檢測。

Q3.非特異性染色

(1).非特異性染色可能是由於自發熒光。

解決方法：用一管只加細胞不加抗體的空白管，查看細胞自發熒光水平。

(2).某些細胞可表達低親和力的Fc受體CD16/CD32，這種受體可通過Fc片段結合大多數抗體。對於小鼠細胞，可使用SeroBlock FcR阻斷該位點。

(3).非特異性染色也可能是由於二抗引起，建議選擇一種只與一抗反應、卻不會與檢測組織發生交叉反應的二抗。

(4).確保洗滌充分。

(5).小心滴定抗體。降低抗體濃度可減少非特異性染色。

Q4.熒光強度弱

(1).熒光弱可能是由於抗體過度稀釋。因此使用前通過正確滴定抗體，以確保抗體濃度適當。

(2).直標時，熒光弱也可能是由於前帶現象引起（概念見表格後解釋），因此，小心正確滴定抗體很有必要。

(3).熒光弱可能由於細胞數量過多。建議正確調整細胞密度，一般低於1×10E7/ml。

(4).熒光弱可能是由於抗原本身就表達低，可通過查閱文獻，明確抗原表達水平。

(5).如果查閱到該抗原確實本身表達弱，那麼建議選擇更亮的熒光素（熒光素亮度排行見：http://www.flowcyto.cn/bbs/thread-2367-1-1.html）。

(6).在交叉反應明顯的抗體中，其熒光強度弱於特異性高的單克隆抗體。

(7).一抗或二抗的孵育時間和溫度均需優化。

Q5.散射光異常

(1).確保細胞是新鮮收集的，否則容易出現大量死細胞和碎片。

(2).對細胞進行刺激、活化時，可影響細胞散射光特性。

(3).如果要裂解紅細胞，確保裂解液新鮮配製並且配製正確。

Q6.結果與預期的相反

(1).有些試劑可能會影響某些抗原檢測，例如EDTA可影響一些血小板標記的檢測。

(2).裂解液也可以影響一些抗原檢測，此時可採用PBMC提取法試試。

(3).有些抗原是表達在胞內的，故需選擇正確的破膜劑進行正確的破膜處理。