CRISPR-cas9：最常用的基因編輯工具
CRISPR-cas9自面世以後，完全改變了基因編輯所需的門檻：大量的基於CRISPR-cas9 系統的實驗方法和治療方法被開發出來，強有力地促進了現代醫療和生物學研究的發展。
本文簡單介紹一下 CRISPR-cas9的來源和原理，因為我也不是做這個的....如果有哪些錯誤請諸位大佬不吝賜教！
CRISPR：細菌的免疫長城
CRISPR（clustered regularly interspaced short palindromic repeats）是細菌中成簇存在的具有規律間隔的短迴文重複序列，是細獲得性免疫抵抗病毒入侵的有效手段。
可是獲得性免疫怎麼會在原核生物中出現？它又沒有複雜的免疫系統！
在噬菌體等病毒侵入細菌時，實際上就是把自己的基因整合進細菌的DNA中，讓細菌大量生產自己的蛋白質外殼和基因，重新組裝成更多的病毒，在細菌終於不堪重負死亡後大量釋放併入侵其他細菌。
CRISPR通過非常巧妙的方法實現了對病毒的獲得性免疫：
當一段外源基因進入細菌後，會與cas核酸酶相結合，形成一段帶有外源基因特徵序列的間隔區（spacer）並摻入到CRISPR基因座內。
這樣就會形成含有spacer序列的CRISPR 基因序列，而各個spacer則用迴文序列（圖中三角形）相隔開，從而轉錄形成具有spacer的CRISPR RNA。
CRISPR RNA因為來源於外源基因，所以它可以和相同的外源基因進行互補配對，藉由crRNA的互補配對引導cas核酸酶破壞靶DNA序列，從而完成整個免疫反應。
因為新的外源基因的進入能夠被CRISPR-cas系統不斷捕獲並摻入CRISPR基因座，從而對相同的基因進行破壞，因此CRISPR 屬於一種獲得性免疫。
CRISPR-cas：刀法決定一切
在CRISPR系統發揮作用的過程中，cas核酸酶是其中最關鍵的一環，目前對CRISPR系統的升級都圍繞著cas酶來進行，不同的細菌中cas核酸酶的種類也不盡相同，它們最大的差別在於對目標序列切除時的準確程度。
cas 的全稱是CRISPR associated protein，它是一種通過crRNA引導的DNA內切酶，如果DNA底物與引導RNA互補，Cas9就會裂解入侵的外源DNA。
編碼cas核酸酶的基因簇位於CRISPR序列的旁邊，現在共發現了可分為35個家族的93種cas基因。目前根據使用的cas酶的不同可將CRISPR-cas系統分為兩大類：
目前來說最常用的還是屬於第二大類的CRISPR-cas9系統，cas9來自釀膿鏈球菌，也有實驗室在做cas12a和cas13d，誰是更準確的那一個目前還有爭議。
而常用的釀膿鏈球菌cas9需要靶位點下游的一個5-NGG-3基序，這段基序被稱為其實就是前間區序列鄰近基序（protospacer adjacent motif，PAM），導致了其可靶向的位置數量受到了限制，所以也有很多研究者在尋找來自其它細菌的cas9酶，看看是否可以突破這種限制。
CRISPR-cas9：最常用的基因編輯工具
一般的CRISPR-cas9 系統包括一段人工合成的Guide RNA 和 cas9酶，人工設計的Guide RNA 代替了細菌中的crRNA，CRISPR-cas9中的Guide RNA包括兩部分：Scaffold 連接至cas9，形成gRNA-cas9 複合物；而spacer中包含了與目標序列互補的rna序列，引導 cas9 複合物與目標基因片段相鄰的PAM序列結合，發揮剪切作用。
CRISPR-cas9 的剪切目標可以是任何長度為20bp左右的DNA序列，但需要滿足兩個條件:
- 這段基因在基因組中獨一無二
- 目標基因和PAM相鄰
cas9核酸酶有兩個內切酶功能域：RuvC和HNH。cas9在與靶基因結合時發生構象變化，最終導致靶DNA (PAM序列上游3-4個核苷酸)內的雙鏈斷裂，這種雙鏈的斷裂可以通過細胞的非同源末端連接和同源末端連接進行修復，但在修復過程中，尤其是非同源末端連接可能會導致無關序列的連接或鹼基的缺失。
參考：
Addgene: CRISPR Guide
CRISPR - Wikipedia
釀酒酵母-3 基因操作技術 (居然是B站上的圖，我才知道原來B站有專業大佬）
推薦閱讀：